DB14∕T 1518-2017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法

ICS65.020.30B43DB14山西省地方标准DB14/T1518—2017晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法2017-12-10发布2018-02-10实施山西省质量技术监督局发布DB14/T1518—2017目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14原理..............................................................................25试验准备..........................................................................26步骤..............................................................................27判定依据..........................................................................38结果表述..........................................................................3附录A（规范性附录）溶液配制说明............................................4附录B（资料性附录）FAO-ISAG推荐引物信息表.................................7附录C（资料性附录）样品DNA的制备及质控检测................................8附录D（资料性附录）PCR反应体系及程序.......................................10附录E（资料性附录）扩增产物的银染检测方法...................................11附录F（资料性附录）数据分析指标及公式.......................................13DB14/T1518—2017II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天合元动物保健科技有限公司。本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、李步高、刘剑锋、杨连仲、王效京、刘宏、孙秉耀、石建中、赵万军。DB14/T1518—20171晋汾白猪种质分子鉴定SSR标记法1范围本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表述。本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求NY/T1673畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。DB14/T1300晋汾白猪3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1SSR标记SSR标记，即简单重复序列（SimpleSequenceRepeats,SSR），又称微卫星DNA，由核心序列和两侧的侧翼序列组成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上，核心序列重复数的差异形成微卫星高度的多态性。3.2参照样品对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。3.3位点对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。3.4核心位点DB14/T1518—20172DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀等特点。3.5扩展位点DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。4原理根据SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用PCR技术扩增目的片段，由于不同个体SSR重复数不等，电泳后不同长度的PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。5试验准备5.1实验仪器设备凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道可调移液器(2μl，10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。5.2试验所用试剂血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、10×TBE或TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、100bpDNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸银、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、dNTPs、TapDNA聚合酶、超纯水。5.3溶液配置溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使用确认为分析纯的试剂。6步骤6.1样品采集6.1.1对于动物样品的采集与保存按照SN/T2123的规定执行。6.1.2采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特征，符合DB14/T1300的要求，采集三代内无血缘关系的个体不少于30头，其中雌性数量不少于1/3。6.1.3样品采集时应详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。6.2样品DNA提取样品DNA的制备方法见附录B。6.3引物合成DB14/T1518—20173使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记30对，引物序列详见附录C。引物合成委托生物公司合成。6.4DNA微卫星位点的扩增及检测6.4.1采用PCR方法扩增所选微卫星引物的目的片段。6.4.2PCR反应体系及程序见附录D。6.4.3扩增产物的检测方法见附录E。6.5基因分型6.5.1利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。6.5.2扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。6.5.3根据片段大小确定等位基因型。6.6数据统计分析6.6.1数据统计分析等位基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基因分化系数、Nei氏遗传距离，具体算法公式见附录F。6.6.2应用GENEPOP软件进行数据分析并进行聚类分析，采用Bootstrap检验可检验所得系统发生树的可靠性。7判定依据7.1品种间差异位点数≧3，判定为不同品种。7.2品种间差异位点数=2或1，判定为近似品种。7.3品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。7.4对7.1和7.2的结果，结合表型检测数据进行综合判定。8结果表述检测位点数为，差异位点数为，判定为遗传相似度为，位点缺失率为，判定为（相同或相近、不同）。DB14/T1518—20174附录A（规范性附录）溶液配制说明A.1DNA提取试剂的配制A.1.1血液裂解液血液裂解液配制见表A.1。表A.1血液裂解液的配制贮存液浓度体积(mL)使用浓度1mol/LTris-HCL（pH8.0）110mmol/L0.5mol/LEDTA（pH8.0）20100mmol/L10%SDS202%灭菌双蒸水加至100—A.1.2组织DNA提取液组织DNA提取液配制见表A.2。表A.2组织DNA提取液的配制贮存液浓度体积（mL）使用浓度1mol/LTris-HCL（pH8.0）550mmol/L0.5mol/LEDTA（pH8.0）20100mmol/L0.5mol/LNaCl20100mmol/L10%SDS202%灭菌双蒸水加至100—A.1.3精子裂解液精子裂解液配制见表A.3。表A.3精子裂解液的配制贮存液浓度体积(mL)使用浓度1mol/LTris-HCL（pH8.0）110mmol/L0.5mol/LEDTA（pH8.0）210mmol/L0.5mol/LNaCl20100mmol/L10%SDS202%1mol/LDDT（现用现加）0.003939μmol/L灭菌双蒸水加至100—A.1.4精子洗涤液DB14/T1518—20175取1mol/LNaCl37.5mL，0.5mol/L的EDTA5mL，加双蒸水至250mL。高压灭菌备用。A.1.50.5mol／LEDTA溶液1.86.1gEDTA-Na22H2O溶于800ml水中，用1mol／LNaOH调PH至8.0，定容至1000mL，在103.4kPa灭菌。A.1.61mol／LTris-HCL溶液60.55gTris-base溶于适量水中，加1mol／LHCL调PH至8.0，定容至500mL，103.4kPa灭菌。A.1.70.5mol／LHCL溶液25mL浓盐酸（36%～38%），加水定容至500mL。A.1.8氯仿-异戊醇（24:1）按24:1的比例（体积比）配制混合液。A.1.9TE缓冲液1mol／LTris-HCL5mL，0.5mol／LEDTA1mL，加HCL调pH至8.0，定容至500mL。A.1.10蛋白酶K贮存液（20mg/mL）200mg蛋白酶K溶于10mL灭菌双蒸水中，分装，每管1mL,-20℃冻存。A.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制A.2.130%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1）200mL水中溶解285g丙烯酰胺，15g甲叉双丙烯酰胺，定容至1L，4℃保存。A.2.26%PAGE胶尿素450g，10xBTE缓冲液100mL，40%PAGE胶150mL，定容至1000mL。A.2.310%过硫酸铵溶液8mL水中溶解1g过硫酸铵，加水至10mL4℃保存。A.2.410xTBE缓冲液Tris-base108g，硼酸55g，EDTA-Na22H2O7.44g，定容至1L。A.2.51xTBE缓冲液10xTBE缓冲液500mL，定容至5L。A.2.66x加样缓冲液去离子甲酰胺（用于DNA变形）49mL，0.5mmol／LEDTA1mL，溴酚蓝0.125g，二甲苯青0.125g。A.3银染试剂的配制DB14/T1518—20176A.3.1固定液200mL冰醋酸，加水定容至2000mL。A.3.2染色液3g硝酸银，加水定容至2000mL。A.3.3显影液2000mL，蒸馏水中加入25g氢氧化钠和7mL甲醛。注：银染溶液的配制可使用符合GB／T6682规定的三级水。DB14/T1518—20177AB附录B（资料性附录）FAO-ISAG推荐引物信息表B.1DNA样品的制备方法B.1.1血液DNA的制备B.1.1.1取适量血液加入等体积血液样品裂解液，加入RNA酶至终浓度为20μg/mL，充分混匀，37℃消化2h。B.1.1.2加入蛋白酶K至终浓度100μg/mL，混匀，55℃水浴消化12h。B.1.1.3加入等体积Tris饱和酚，反复颠倒混匀，4℃12000r/min离心15min；吸取上清液转移至另一离心管中。B.1.1.4加入等体积苯酚：氯仿那个：异戊醇（25：24：1）混合液，缓慢颠倒离心管使溶液充分混匀，4℃12000r/min离心15min，吸取上清液至另一离心管中。B.1.1.5加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管至白色絮状物DNA沉淀出现，冰浴20min，4℃12000r/min离心15min。B.1.