DB21T 2742-2017 饲料中动物源性成分-貂源性组织成分定性检测方法PCR 方法

ICS65.120B46DB21辽宁省地方标准DB21/T2742—2017饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法AnimalderivedingredientsinFeed-qualitativedetectionofminktissuederivedingredientswithPCRmethod2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2742—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。本标准由辽宁省质量技术监督局归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。DB21/T2742—20171饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法1范围本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。本方法的貂源性成分检测限为0.5%（w/w）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T19495转基因产品检测GB/T20195动物饲料试样的制备SN/T1193基因检验实验室技术要求3原理利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。4试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。4.1引物根据Primer6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为：F：5’-TTAGTAGCTCATAACGCCTTG-3’R：5’-CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG-3’根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。4.2BstXⅠ限制性内切酶。4.3PCRMastermix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。4.4基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。4.5裂解缓冲液：250mmol/LSDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。DB21/T2742—201724.6TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。4.7胶回收试剂盒或其他替代试剂。4.8电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。4.9琼脂糖：分子生物学级别。4.10溴化乙锭贮存液（10mg/mL）或荧光染料替代品。4.11DNA分子量标准品（100bp-1000bp）。5仪器设备5.1分析天平：感量为0.01g和0.0001g。5.2台式离心机：离心力12000r/min。5.3水浴锅：温度可调范围为28℃-95℃，误差为±0.5℃。5.4PCR仪。5.5电泳仪。5.6凝胶成像仪。5.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（可测量微量样品）。6测定程序饲料中貂源性成分测定程序见图1。DB21/T2742—20173图1饲料中貂源性成分测定程序图7操作步骤7.1制样按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减，取约200g，经粉碎，全部过0.45mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。7.2模板提取称取50mg试样于1.5mL离心管中，加入200μLTE，混匀；加入400μL裂解液，加400μL三氯甲烷，混匀；10000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10000r/min离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。也可采用等效的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。7.3核酸浓度及纯度检测提取的DNA采用紫外分光光度计在260nm和280nm处检测其吸光值，紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL-50μg/mL，OD值应在0.05-1.0区间内。1OD260=50μg/mL双链DNA，用水稀释，调整DNA浓度至20µg/mL。用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.8，如低于1.8则重新进行DNA的提取。7.4PCR扩增7.4.1PCR反应体系DB21/T2742—20174按表1的体系进行PCR反应液的配制。表1PCR反应体系成分鉴定体系PCRMasterMix25μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μLDNA模板100ng±50ngddH2O调整体系体积至50μL7.4.2PCR扩增参数按表2的条件进行PCR反应。表2PCR反应条件反应预变性扩增延伸循环数1301温度/℃9595487272时间5min30s30s45s5min7.4.3质控样品检测过程中分别设阳性对照和空白对照。在貂源性成分的鉴定中，以貂肉粉末作为阳性对照。PCR过程中，以水作为空白对照。7.4.4PCR扩增产物电泳检测取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μl-10μLPCR扩增产物点样。9V/cm恒压电泳，直到指示剂迁移至凝胶尾部。凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。7.4.5限制性内切酶酶切反应酶切反应体系为20µL，具体见表3，酶切条件根据说明书操作，电泳分析。表3酶切反应体系成分体积/µL10×Buffer2限制性内切酶BstXⅠ2PCR产物7ddH2O97.4.6PCR扩增产物测序DB21/T2742—201757.4.6.1PCR扩增产物回收采用经验证的胶回收试剂盒进行电泳后的PCR目的片段回收，按照试剂盒使用说明书回收DNA。7.4.6.2PCR扩增产物测序将特异性条带进行琼脂糖凝胶回收，纯化并委托测序，测序结果见附录A。7.5结果表述7.5.1PCR扩增产物电泳检测结果貂源性成分扩增产物为622bp，序列参考附录A，图谱见附录B。貂源性成分的PCR产物被BstXⅠ酶切为107bp和515bp两个片段，图谱见附录B。7.5.2结果判定PCR产物为阳性，同时酶切结果符合附录B、测序结果同源性达到99%判为含有貂源性成分，表述为检出貂源性成分；PCR产物为阴性者，不需要再进行酶切和测序鉴定，判为不含有貂源性成分，表述为未检出貂源性成分。8检测过程中防止交叉污染的措施参考GB/T19495.2《操作过程中避免交叉感染》和SN/T1193《基因检验实验室技术要求》执行。DB21/T2742—20176AA附录A（资料性附录）貂源性成分PCR产物测序结果CAGTGATAAAAATTAAGCCATGAACGAAAGTTTGACTAAGCCATGTTAACACCAAGAGTTGGTAAATTTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAATCAATGGGCCAACGGCGTAAAACGTGTTAAGGACTATACAACACTAAAGTTAAAATTTAACCAGGCCGTAAAAAGCTACTGTTAATACAAAACAAACCACGAAAGTGACTTTACCACTTCCGACAACACGATAGCTGAGATCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTCAGCCCTAAACATAAATAATTCACATAACAAAATTACTTGCCAGAGAATGTTAAAGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCTCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCACTTCTAGCTAAATCAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTTAAAAAGGAAGAAAAGTAAGCACAATAATGATACATAAAAAAGTTAGGTCAAGGTGTAACCCAGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTAACCAAGAAAATACTCACADB21/T2742—20177BB附录B（资料性附录）貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图图B.1貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图（LaneM：DL1000；Lane1：貂源性成分的扩增产物；Lane2-3：貂源性成分PCR产物酶切结果）_________________________________