DB21∕T 2592.3-2016 鸡传染性疾病检测方法 第3部分鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2592.3—2016鸡传染性疾病检测方法第3部分：鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法DetectionmethodofchickeninfectiousdiseasePart3:Thetestingmethodofreal-timefluorescentPCRforchickenMarek'sdisease2016-03-18发布2016-05-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2592.3—2016I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13缩略语............................................................................14仪器与器材........................................................................14.1仪器..........................................................................14.2器材..........................................................................15试剂和材料........................................................................26操作步骤..........................................................................26.1样品的采集、存放和运送........................................................26.1.1采样工具..................................................................26.1.2样品的采集................................................................26.1.3存放与运送................................................................26.2实时荧光PCR检测..............................................................36.2.1DNA提取...................................................................36.2.2扩增体系的配制............................................................36.2.3加样......................................................................36.2.4荧光PCR扩增检测..........................................................37结果判定..........................................................................37.1阈值设定......................................................................37.2质控标准......................................................................47.3结果描述及判定................................................................4附录A（规范性附录）磷酸盐缓冲生理盐水配方..........................................5DB21/T2592.3—2016II前言标准《鸡传染性疾病检测方法》按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。标准《鸡传染性疾病检测方法》分为三个部分：——鸡传染性法氏囊病毒实时荧光RT-PCR检测方法——鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法——鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法本部分为标准《鸡传染性疾病检测方法》的第3部分本部分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本部分由辽宁省畜牧兽医局归口。本部分起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本部分主要起草人：王宏燕、曹东、闫海滨、石霖、赵培、何欣、薛树山、齐德林、李井春、马建山、姚伟、孙洪志DB21/T2592.3—20161鸡传染性疾病检测方法第3部分：鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了鸡马立克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于鸡马立克氏病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。MDV：鸡马立克氏病毒（Marek'sdiseasevirus）Ct值：循环阈值（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（real-timefluorescentpolymerasechainreaction）PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphatebuffersaline）4仪器与器材4.1仪器4.1.1分析天平4.1.2高速离心机4.1.3荧光PCR扩增仪4.1.4冰箱（4℃，-20℃，-70℃）4.1.5水浴锅4.1.6微量移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）4.2器材4.2.1组织匀浆器或研钵4.2.2眼科剪4.2.3眼科镊4.2.4刀片4.2.51.5mL灭菌离心管4.2.6PCR八联排管或96孔板DB21/T2592.3—201624.2.7吸头（10μL，200μL，1000μL）4.2.8灭菌双蒸水4.2.9称量纸5试剂和材料除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。5.1DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4℃～8℃保存。5.2SYBR®GreenⅠ试剂盒：-20℃长期保存，融化后于4℃～8℃保存（不超过1个月）。5.3PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（0.02mol/LpH7.2）。5.4无水乙醇：-20℃预冷。5.575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。5.6阴性对照：灭菌双蒸水。5.7阳性对照：MDV细胞培养物。6操作步骤6.1样品的采集、存放和运送6.1.1采样工具15mL离心管和1.5mL离心管经121℃±2℃高压灭菌15min；眼科剪、眼科镊、组织匀浆器或研钵、刀片经160℃干热灭菌2h。6.1.2样品的采集6.1.2.1组织样品的采集采取病鸡或活鸡的肝脏、肾脏和脾脏等组织，装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。取100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。6.1.2.2皮肤的采集皮肤要选病变明显部分的边缘，采取少许放入1.5mL离心管中送检，编号备用。6.1.2.3羽毛的采集羽毛选病变明显部分，用刀片刮取羽毛及根部的皮屑少许，放入1.5mL离心管中编号备用。6.1.2.4细胞培养物的采集将产生马立克氏病毒蚀斑的细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。6.1.3存放与运送采集的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品生物安全标识。DB21/T2592.3—201636.2实时荧光PCR检测6.2.1DNA提取在核酸提取室进行。6.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。6.2.1.2每管加入800μLDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；4℃10000g离心10min。6.2.1.3取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min；4℃10000g离心5min。6.2.1.4弃上清，沿管壁缓缓加入1mL75%乙醇，混匀，4℃10000g离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。6.2.1.5用20µL灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20℃冰箱保存备用。6.2.2扩增体系的配制在配液区进行。设实时荧光PCR反应数为n，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系配制见表1，向每个荧光PCR管或96孔板孔中分装23µL的反应体系。表1每个样品反应体系配制表体系组分用量SYBR®GreenⅠ12.5µL上游引物F0.8µL下游引物R0.8µLROXReferenceDye（50×）0.5µL灭菌双蒸水8.4µL总量23µL6.2.3加样在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管或96孔板孔中加入6.2.1中制备的2µLDNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。6.2.4荧光PCR扩增检测在扩增室进行。6.2.4.1将6.2.3中离心后的PCR管或96孔板放入荧光PCR扩增仪内，注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。6.2.4.2反应条件设置：95℃30s；95℃10s；65℃34s；35个循环。荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行。7结果判定7.1阈值设定DB21/T2592.3—20164试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7.2质控标准7.2.1阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线。7.2.2阳性对照Ct值应28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。7.3结果描述及判定7.3.1阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无MDV核酸。7.3.2阳性Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在MDV核酸。7.3.3可疑Ct值30.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果Ct值≤30.0并出现典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。DB21/T2592.3—20165AA附录A（规范性附录）磷酸盐缓冲生理盐水配方A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢