DB32∕T 3115-2016 菊花脱毒种苗生产技术规程

ICS65.020.20B05备案号：51460-2016DB32江苏省地方标准DB32/T3115-2016菊花脱毒种苗生产技术规程Technologyofvirus-freechrysanthemumstockproduce2016-09-20发布2016-11-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T3115-2016I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13待脱毒材料.........................................................................14脱毒处理...........................................................................15病毒检测...........................................................................26脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽...................................................27脱毒原种苗的生物性状观察...........................................................38脱毒原种苗的繁殖...................................................................39建立脱毒苗母本圃...................................................................310脱毒种苗的质量检测................................................................311包装与贮运........................................................................3附录A（规范性附录）RNA病毒的反转录——聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法...........5DB32/T3115-2016II前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》组织编制。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：陈素梅、管志勇、吴丹、张飞、房伟民、蒋甲福、陈发棣。DB32/T3115-20161菊花脱毒种苗生产技术规程1范围本标准规定了菊花脱毒种苗生产技术要求和规程.本标准适用于常见菊花脱毒种苗的生产。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。NY/T1591-2008菊花切花种苗等级规格DB32/T1530-2009切花菊种苗生产技术规程3待脱毒材料凡有待进行脱毒处理的品种均应是通过合法途径引进的，签署有关品种权保护协议，或者经自主选育的、具有知识产权的品种。4脱毒处理4.1茎尖培养脱毒4.1.1无菌苗再生体系的建立经检测含有特定病毒的菊花，取其越冬脚芽，进行外植体表面灭菌，具体步骤如下：剪除茎段上的叶片，用流动的蒸馏水冲洗15分钟后，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%酒精浸泡30s，再转移到0.1%升汞中洗涤3～5min，取出，用无菌水冲洗5～6次，每次不少于3min，经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小段，每段长2-3cm，带有1～2腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶1～2个茎段。4.1.2剥取茎尖在超净工作台上操作，于解剖镜下，将材料置于消毒的滤纸上，用经消毒的手术刀和解剖针逐步剥去外层叶片，切取0.5～1.0mm直径大小的带有1～2片叶原基的茎尖顶端组织。4.1.3分化培养将剥取的茎尖接种于经过高温湿热灭菌的分化培养基上，并对接种的茎尖分别编号，置于25℃、光照强度1500～3000lx、光照时间16h/天的条件下培养，2～3个月后可分化出新芽。DB32/T3115-201624.1.4诱导生根切取1～2cm分化出的新芽接入生根培养基中，在25℃和光照强度1500～3000lx条件下，培养15～20d可长出新根。对每株生根苗进行编号。4.2热处理结合茎尖培养脱毒4.2.1热处理方法将待脱毒的菊花植株放入光照培养箱中，采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26℃/20℃下培养2d，而后每两天昼/夜温度分别升高2℃，直至38℃/30℃，该温度下培养40d。光照时间16h/天，光强为2000lx。剥取热处理过程长出的新梢顶端0.3～0.5mm的茎尖进行组织培养。4.2.2热处理茎尖培养脱毒按照4.1茎尖培养脱毒方法进行培养，分化出苗、转接生根，对每株生根苗进行编号。5病毒检测5.1主要病毒种类菊花B病毒ChrysanthemumvirusB（CVB)番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus（TAV)番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus（TSWV)黄瓜花叶病毒Cucumbermosaiccucumovirus（CMV)菊花矮化类病毒Chrysanthemumstuntviroid（CSVd)菊花萎黄斑驳类病毒Chrysanthemumchloroticmottleviroid(CChmvd)。5.2检测病毒，见附录A。取2～3cm高的植株叶片组织作为检测样品，确认不带病毒的材料为脱毒原种苗，用于进一步繁殖。6脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽6.1脱毒原种苗保存将脱毒原种试管苗转接到MS琼脂培养基上，置于20～25℃的光照培养室中保存，20～30d继代转接一次，继代次数控制在10～15代。6.2脱毒原种苗的扩繁DB32/T3115-20163调节增殖培养基中细胞分裂素和生长素浓度的比例，使增殖比控制在2.5～3.5倍之间。切取增殖后的组培不定芽，转接至生根培养基中进行生根培养。6.3脱毒原种苗的炼苗移栽瓶苗株高6～7cm，5～6平展片，具5条以上3～4cm长的根时即可炼苗。炼苗以泥炭：珍珠岩（1:1,V/V）为基质，铺于苗床或穴盘内。将组培生根苗至于光亮处锻炼2～3天，将其从组培瓶中取出，洗去根部附着的培养基，然后种植于上述苗床或穴盘内，20～30天后，每周浇1/4至1/8浓度的MS营养液以促进生长。温度控制在15～25℃。7脱毒原种苗的生物性状观察随机抽取每个无性系脱毒苗5～10株，与其母株一并种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原种苗，有差异则淘汰整个无性系。8脱毒原种苗的繁殖8.1组织培养繁殖按照3.4.2脱毒苗扩繁的方法进行。8.2扦插繁殖参照DB32/T1530-2009中的7、8、9执行。9建立脱毒苗母本圃保护地栽培，在防虫温室内作苗床栽培或地栽。土壤或基质须经蒸汽或药剂消毒，定植前施颗粒有机肥（1kg/m2），pH值6～7，电导率0.8～1.2。10脱毒种苗的质量检测脱毒种苗的质量检测参照NY/T1591-2008中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T1591-2008中5.2的内容进行检测，确定种苗的质量等级。11包装与贮运11.1包装种苗袋选用材质为0.05～0.08mm的透明塑料薄膜，大小为35cm×35cm，袋上打12～16个直径5mm的透气孔。每袋装种苗50～100株，袋装时须将带基质的根部朝下，茎叶部朝上，整齐排列，然后装入专用种苗箱。包装箱材质应为双瓦楞纸箱，种苗箱应有良好的承载能力和耐湿性，宽40cm，长60cm，DB32/T3115-20164高20cm～22cm，两侧留有透气孔。装箱时种苗袋应直立排放，每箱放置500～1000株。装箱后用胶带封好箱口。11.2包装标识包装箱(图1)上应有明显标识，内容包括：产品名称、质量等级、包装容量、生产单位、产地、采收包装日期，若需冷藏保存，应注明冷藏温度。标识内容要求字迹清晰、完整、规范。图1种苗包装箱11.3贮运可在2～5℃冷库中贮存，贮存时间不超过7d。种苗运输时间超过3d时，则应采用控温4～6℃的冷藏车。DB32/T3115-20165AA附录A（规范性附录）RNA病毒的反转录——聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法A.1设备和材料枪头、离心管和PCR管均需经高温消毒。A.1.1微量移液器：200~1000μL、20~200μL、10~100μL、0.5~10μL、0.5~2.5μL、0~1.0μL。A.1.2电子天平：精度为0.01g。A.1.3高速冷冻离心机。A.1.4PCR仪。A.1.5水平凝胶电泳系统。A.1.6凝胶成像系统。A.2药品和试剂所用试剂为分析纯，水为灭菌的双蒸水。A.2.1RNA提取试剂Trizol，氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC水，双蒸水。A.2.2反转录试剂M-MLV反转录酶，5×M-MLV缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，随机引物，10mmol/LdNTP。-20℃贮藏。A.2.3PCR试剂TaqDNA聚合酶，10×Buffer，PCR引物（上游，下游）。A.2.45×TBE缓冲液A.2.5加样缓冲液0.25%溴酚蓝溶解于40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。A.3操作步骤A.3.1菊花总RNA的提取菊花总RNA的提取按照TaKaRa公司提供的Trizol试剂盒说明书进行，具体步骤包括：(1)取菊花叶片l00mg，用液氮研磨，加入1mL的RNA提取液，混合均匀，于冰上静置5min。(2)4℃，12000g高速离心10min，吸取上层溶液转移到新的1.5mL的EP离心管中。(3)向离心管中加入1/5体积的氯仿溶液，振荡，混合均匀，于室温下静置5min。(4)4℃，12000g高速离心15min，吸取上层溶液转移到新的1.5mLEP离心管中。(5)重复步骤(3)、(4)两次。DB32/T3115-20166(6)向1.5mLEP管中加入等体积的异丙醇(预冷)，摇匀，室温下静置10min。(7)4℃，12000g高速离心l0min，弃上清。(8)用1mL75%的乙醇洗涤2~3次，12000g高速离心10min，弃上清，于超净工作台上通风干燥RNA，并加入30μL的无RNase的DEPC水溶解。(9)取2μL的RNA加58μL的DEPC水稀释，用核酸定量仪在260/280nm测量RNA的浓度及纯度。(10)取2μL的RNA溶液，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，其余的RNA放置于-80℃保存备用。A.3.2第一链cDNA合成cDNA合成参照试剂盒(M-MLVRTasecDNASynthesisKit,TaKaRa)，具体步骤如下：(1)在离心管中配制下列混合液:TotalRNA(10pg-5μg)1μLRadomPrimer(25μM)1μLRNaseFreedH2O4μL(2)-70℃保温10min后，迅速在冰上放置2min以上。(3)离心数秒，使模板RNA/引物变性溶液聚集于离心管底部。(4)在上述Microtube管中配置下列反转录反应液：上述模板RNA/引物变性溶液6μL5×M-MLVBuffer2μLdNTPsMixture(10mMeach)0.5μLRNaseInhibitor(40U/nl)0.25μLRTaseM-MLV(RHaseH-)(200U/μL)0.4μLRNaseFreedH2O0.85μL(5)30℃保温10min