DB22T 2567-2016 肺炎链球菌核酸检测PCR法

ICS07.100C04备案号：54244-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2567—2016肺炎链球菌核酸检测PCR法PolymerasechainreactionmethodforthedetectionofStreptococcuspneumoniae2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2567—2016I前言本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：王慧、杨修军、张炜煜、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2567—20161肺炎链球菌核酸检测PCR法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了肺炎链球菌核酸检测PCR法。本标准适用于肺炎链球菌核酸的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应，简称PCR3.2DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸3.3dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸3.4dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸3.5dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸3.6dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸3.7dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸3.8Bp：basepair，碱基对4试剂和材料除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。4.1水：应符合GB/T6682-2008中一级水的规格4.2DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒4.310×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化镁4.44dNTP（10mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2567—201624.5TaqDNA聚合酶4.6分子量标记：100bp～2000bpDNA条带（DNALadder）4.710×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。4.8琼脂糖：电泳纯4.9溴化乙锭4.10质控菌株：肺炎链球菌ATCC496194.11阳性对照：肺炎链球菌ATCC49619菌体DNA4.12肺炎链球菌种特异性引物CpsA-F：5’-GGTGTTCTCTATCCTTGTCAGCTCTGTGTCGCTC-3’CpsA-R：5’-GTGTGAATGGTCGAATCAACTCTAAATGCC-3’5仪器和设备5.1PCR仪5.2生物安全柜5.3涡旋混合器5.4金属浴（或水浴锅）5.5高压灭菌器5.6微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL5.7静脉采血管5.8冷藏冷冻冰箱（2℃～8℃和-20℃）5.9电泳仪（或毛细管电泳仪）5.10高速离心机（13000rpm以上）5.11凝胶成像仪（或紫外透射台）6检验程序6.1样品采集6.1.1培养物用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于200μL无菌双蒸水中，振荡混匀形成悬浮菌液。6.1.2血液采集静脉血（3mL～5mL）置于含有抗凝剂的采血管中，并标记。6.1.3脑脊液应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集的脑脊液（要求1mL）置于无菌、螺帽管中，并标记。6.1.4咽拭子将咽拭子绕过悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3滴～5滴无菌生理盐水的试管中，待检。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2567—201636.2细菌DNA的提取对于上述标本，各取0.1mL加到一个0.2mL无菌双蒸水中，振荡混匀，100℃煮沸10min，13000rpm/min离心10min，吸取上清液即为DNA模版；使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，试剂对照。如不能及时检测，提取的DNA可置于-20℃保存。6.3PCR扩增6.3.1引物表1引物序列菌名称引物序列DNA片段（bp）CpsA-F:5’-GGTGTTCTCTATCCTTGTCAGCTCTGTGTCGCTC-3’肺炎链球菌种特异性CpsA-R:5’-GTGTGAATGGTCGAATCAACTCTAAATGCC-3’6576.3.2PCR反应体系25μL反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP2μL，1UTaq酶，10pmol/L引物上下游各1μL，模板DNA1μL，双蒸水补足25μL。6.3.3PCR扩增条件94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，室温放置30min。6.4电泳及凝胶成像秤取2.0g琼脂糖加入100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加入适量的溴化乙锭（0.5μg/mL）,然后制成凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5μL～10μLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9V/cm恒压下电泳30min～35min。将电泳好的凝胶放到凝胶成像仪或紫外透射台上观察结果，进行判断并做好试验记录。7结果判读7.1结果判定若样品PCR扩增产物电泳出现657bp扩增条带，同时阳性对照扩增产物电泳后出现目的条带657bp，阴性对照、空白对照和试剂对照电泳后没有出现目的条带，判定结果可疑阳性。样品PCR扩增产物电泳无目的条带，且阳性对照扩增产物电泳后出现目的片段，阴性对照、空白对照和试剂对照电泳后没有出现目的条带，判定结果为阴性。7.2结果表述如判定结果为阳性，则结果表述为“肺炎链球菌核酸检测阳性”；如判定结果为阴性，则结果表述为“未检出肺炎链球菌核酸”。8废弃物处理和防止污染的措施本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2567—201648.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌30min后再弃置。8.2为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按GB19489-2008中的有关规定执行。8.3检验过程中防止交叉污染的措施见WS/T230-2002中污染的预防和控制措施。_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印