DB21∕T 2465-2015 新城疫强弱毒株R∕T-PCR鉴别诊断技术

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2465—2015新城疫强弱毒株RT-PCR鉴别诊断技术MethodofRT-PCRthatDistinguishesLentogenStrainsFromVirulentStrainsof-NewcastleDiseaseVirus2015-04-30发布2015-06-30实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2465—2015I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准由辽宁省质量技术监督局发布。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：吴运谱、顾贵波、石霖、薛树山、杨作丰、王宏燕、马建山、闫海滨、何欣、王志国、张爽DB21/T2465—20151新城疫强弱毒株RT-PCR鉴别诊断技术1范围本标准规定了新城疫强毒株、弱毒株的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于禽类棉拭子样品、组织样品及相关样品的尿囊液的新城疫病毒强、弱毒株的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。NDV：新城疫病毒DEPC：焦炭酸二乙酯PBS：磷酸盐缓冲生理盐水BSA：牛血清白蛋白RNA：核糖核酸BP：碱基对RT-PCR：反转录聚合酶链式反应Taq酶：TaqDNA聚合酶Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数4原理通过对大量强毒株和弱毒株的序列比对分析，设计其相应的引物及其探针。探针5′端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3′端标记MGB荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），其在近距离内能吸收5′端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5′→3′的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5仪器与器材DB21/T2465—20152高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱（2～8℃，-20℃和-70℃三种）、荧光PCR扩增仪、分析天平、1.5mL离心管、0.5mLPCR反应管、微量移液器和吸头（1000μL、100μL和10μL三种）。6试剂与材料6.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃预冷。6.3异丙醇：4℃预冷。6.475%乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。6.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121±2℃，高压灭菌15min。6.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。6.10阴性对照：DEPC水。6.11阳性对照：疫苗株（Clone30株）、标准强毒株F48E9。6.12PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.13引物：用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，鉴别引物及其探针见下表1。表1鸡新城疫强、弱毒株鉴别诊断RT-PCR引物及其探针毒株类型引物及探针名称引物及探针序列(5′-3′)位置(BP)扩增片段长度探针修饰方式LF3TCCGBAGGATACAAGAGTCYGTGACCLF4TCCGBAGGATACAAGAGTCYGTGACT4839–4864LR2AGAGCYACACCGCCAATAATLR3AGAGCYACACCACCGATAAT4923–4904弱毒株Lprobe2CAGGGRCGCCTTATA4883–489785bp探针Lprobe2为5′FAM标记，3′端MGB标记VF1GAYTCYATCCGYAGGATACAAGRGTC4832–4857VR2AACCCCAAGAGCTACACYRCCVR3GACCCCAAGAGCTACACYRCC4930–4910Vprobe1AARCGTYTCTGYCTCC4893–4878强毒株/中强毒株Vprobe2AGARACGCTTTRTAGGTGC4884–490299bp探针Vprobe1、Vprobe2均为5′FAM标记，3′端MGB标记注：B=C,G或T；Y=T或C；R=G或A7操作步骤7.1样品的采集、保存和处理7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应防止样本间交叉污染。DB21/T2465—201537.1.2采样工具离心管（1.5mL、15mL）经121±2℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干烤2h。7.1.3样品的采集病死禽，采集其气管及其分泌物或肺脏。活禽样品的采集：咽喉拭子采样，要将棉拭子（医用棉签）深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；泄殖腔棉拭子采样，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。将活禽的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0mLPBS的离心管中，编号备用。7.1.4样品的保存采集好的样品应保存在PBS液（pH7.0～7.4,0.01mol/L）或0.85%生理盐水或者不含有血清的细胞培养液（均含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL）中，置于加冰的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存，并按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.1.5样品的处理用剪刀将组织病料在研磨器中剪碎，按质量体积比（1:1）加入样品保存液进行研磨；将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品在室温条件下静置作用30min，4℃3000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。若样品为鸡胚增殖病毒的尿囊液，直接采用尿囊液进行核酸提取。7.2核酸的提取7.2.1编号取n个灭菌的1.5mL离心管（n为待检样品数与阳性对照管数与阴性对照管数之和），并逐一编号。7.2.2裂解每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，颠倒10次混匀，在室温条件下静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s（也可以用手反复颠倒混匀）。4℃12000g离心15min。7.2.3沉淀取与7.2.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取7.2.2中离心后的上清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，在室温条件下静置15min。7.2.4洗涤DB21/T2465—201544℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇，颠倒洗涤。7.2.5干燥4℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。4000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，在室温条件下干燥3～10min。7.2.6溶解加入20μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增，于-70℃冰箱长期保存。7.3RT-PCR检测7.3.1RT-PCR反应体系1）检测弱毒株时，检测体系的上、下游引物及探针用量见表2。表2弱毒株检测体系的上、下游引物及探针用量上游PCR引物LF3、LF4各0.75μL下游PCR引物LR2、LR3各0.75μL探针Lprobe2（10μmol/L）1.5μL2）检测强毒株、中强毒株，检测体系的上、下游引物及探针用量见表3。表3强毒株检测体系的上、下游引物及探针用量上游PCR引物VF11.5μL下游PCR引物VR2、VR3各0.75μL探针Vprobe1、Vprobe2（10μmol/L）各0.75μL3）在1）、2）基础上分别加入表4中的成份，形成25μL反应体系，用于强、弱毒的RT-PCR检测。表4强、弱毒株鉴别诊断RT-PCR检测体系中除引物和探针外的其他成份10×PCRBuffer2.5μL灭菌蒸馏水8.5μLHSTaqDNA聚合酶0.25μLAMV反转录酶（5U/μL）0.25μLdNTP(2.5mmol/L)0.5μLMgCl2(25μmol/L)3.0μLBSA(5mg/ml)0.5μL样品核酸5.0μL灭菌蒸馏水8.5μLDB21/T2465—201557.3.2检测条件设置将探针检测模式设置为ReportDye：FAM，QuencherDye：MGB,PassiveReference：None；反应条件设置为50℃15min,95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃60s（收集荧光）,45个循环。保存文件，运行。7.4结果判定7.4.1结果分析条件设定阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。7.4.2质控标准1)阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。2)阳性对照的Ct值应≤28.0,并出现特定的扩增曲线。3)如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。7.4.3结果描述及判定1）弱毒株的判定阳性对照成立，阴性对照没有Ct值且无扩增曲线，样品出现扩增曲线且Ct值≤28.0，判定为新城疫弱毒株。2）强毒株的判定阳性对照成立，阴性对照没有Ct值且无扩增曲线，样品出现扩增曲线且Ct值≤28.0，判定为新城疫强毒株。DB21/T2465—20156AA附录A（资料性附录）磷酸盐缓冲生理盐水配方A.1A液0.2mol/L磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.2B液0.2mol/L磷酸二氢钠溶液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H20)31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.30.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制量取0.2mol/L的A液360mL，0.2mol/L的B液140mL，称取氯化钠38g，用无离子水溶解稀释至5000mL，4℃保存。_________________________________