DB12T 521-2014 牛结核病噬菌体检测技术规范

MycobacteriophagetbovinetsfordetectionDB12ICS11.220B41天津市地方标准DB12/T521—2014牛结核病噬菌体检测技术规范Theechnicaltandardofuberculosisby2014-04-22发布2014-07-20实施天津市质量技术监督局发布DB12/T521—2014I前言本标准的编写符合GB/T1.1-2009的要求。本标准由天津市畜牧兽医局提出。本标准由天津市动物卫生监督所起草。本标准主要起草人：刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖、赵晶。本标准于2014年4月发布。DB12/T521—20141牛结核病噬菌体检测技术规范1范围本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测、结果判定、注意事项。本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3定义3.1噬菌体Bacteriophage,简称phage噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。3.2噬菌斑plaque在人工培养基上，细菌在噬菌体的作用下裂解形成的圆形斑，称为噬菌斑。4设备和仪器a生物安全柜b离心机（4000r/min）c振荡器d水浴锅（55℃）e恒温培养箱f有盖离心管（50mL）g无菌试管（10mL）h移液管（10mL）i三角瓶（100mL，500mL）j平皿（90mm）k移液器及配套吸头（100μL，1000μL）5培养基和试剂培养基和试剂配制方法见附录A6检测6.1样本的采集2按照NY/T541进行样本采集。6.2样本的处理6.2.1牛乳取牛乳5mL于50mL有盖离心管中，加10mL的3%NaoH溶液；振荡混匀，室温孵育15min；加灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15min，弃去上清液；再加灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15min后弃去上清液；加1mL灭菌完全培养基重悬沉淀物，无菌条件下转移至10mL无菌试管中。6.2.2口鼻分泌物取2mL牛口鼻分泌物（或2mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品）于50mL有盖离心管中，处理方法同6.2.1。6.3检测6.3.1阴性对照：吸取1mL灭菌完全培养基于10mL无菌试管中，为“阴性对照”。6.3.2阳性对照：取50μL指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0×106cfu/mL，取1mL稀释后的溶液于10mL无菌试管中，为“阳性对照”。6.3.3灭菌双蒸水空白对照：灭菌双蒸水处理方法同6.2.1。6.3.4在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100μL噬菌体D29溶液，混匀，于37℃水浴锅中孵育2h；6.3.5上述反应管中分别加100μL杀病毒剂，充分混匀，置于室温10min；6.3.6上述反应管中分别加8mL完全培养基，混匀；6.3.7上述反应管中分别加1mL指示细胞溶液，混匀；6.3.8快速将反应管中所有的内容物分别倒入相应的空的90mm的无菌平皿中；立即加8mL冷却至55℃左右的琼脂培养基于各平皿中，快速混匀，置于室温定型；6.3.9将平皿倒置于37℃培养箱中培养，18h~24h后判读结果。7结果判定当阳性对照平皿中噬菌斑数目≥20个，阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个，同时无菌双蒸水空白对照均无噬菌斑时，试验成立。受检样品平皿中出现大小不等的噬菌斑且≥20个噬菌斑，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量＜20个判定为阴性。8注意事项8.1试验前需将所有试剂和样本回复至室温。8.2加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以杀死全部未进入菌体里的噬菌体。8.3由于临床样本中可能含有病原体，因此所有操作过程应符合相关生物安全操作规程，如不得用口直接接触移液器，正确使用手套、生物安全罩衣、口罩等相应的安全防护设施。8.4检测结束后，实验用品和废弃物，应进行高温高压或其他生物安全处理。DB12/T521—2014DB12/T521—20143附录A（规范性附录）培养基和试剂配制方法A.1Middlebrook7H9基础培养基将Middlebrook7H9基础培养基（自购）4.7g加入900mL蒸馏水（或去离子水）中，充分混匀，溶解，121℃灭菌10min，冷却至室温后使用。置于25℃下贮存，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。A.2完全培养基无菌条件下，将小牛血清复合物20mL加至无菌已冷却的180mL7H9基础培养基中，制得完全培养基。4℃保存备用，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。A.33%NaoH溶液取NaoH30g，溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌10min，冷却后备用。A.4噬菌体D29溶液自购，用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0×108Pfu/mL，4℃保存备用。A.5指示细胞溶液耻垢分枝杆菌（ATCC，607，自购），用无菌完全培养基将指示细胞配制成浓度为1.0×106cfu/mL，4℃保存备用。A.6杀病毒剂将50mL浓硫酸加入到800mL蒸馏水中，冷却后再溶入40g硫酸亚铁铵。在容量瓶中稀释到1000mL，4℃保存备用。贮存过程中，该溶液可能褪色或产生沉淀，但不影响其使用。A.7琼脂培养基将1.5g琼脂培养基干粉加入100mL7H9基础培养基中，充分混匀，加热溶解，121℃灭菌10min冷却至55℃左右时使用。置于25℃条件下贮存，有效期4周。再次使用则需加热融化，重融次数不得超过3次。