DB21∕T 2280-2014 水产养殖用扁藻培养操作技术规程

ICS65.150B51DB21辽宁省地方标准DB21/T2280—2014水产养殖用扁藻培养操作技术规程TechnicalSpecificationforculturingofTetraselmisChuiusinginaquaculture2014-04-09发布2014-06-09实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2280—2014I前言本标准的附录B为规范性附录，附录A和附录C为资料性附录本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：张明、王笑月、林杉杉、李华琳。DB21/T2280—20141水产养殖用扁藻培养操作技术规程1范围本标准给出了水产养殖用扁藻培养的术语和定义。规定了扁藻培养的水质条件和设施设备、消毒方法、培养液的配制、藻种来源、培养方法、日常管理、敌害生物防治等内容。本标准适用于水产养殖用扁藻的培养。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB11607渔业水质标准NY5052无公害食品海水养殖用水水质NY5071无公害食品渔用药物使用准则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1单种培养在不排除细菌存在的条件下进行的单一藻种培养的方法。3.2接种在无敌害生物和杂藻污染的条件下，把选中的藻种转移到事先配好的培养基使其繁殖增长的一种操作。3.3封闭式培养将藻种在封闭透明的容器中进行培养的方法。容器除了充气管、加液管和藻液抽出管外，不与外界接触。3.4开放式培养将藻种在敞开的容器中进行培养的方法。DB21/T2280—201423.5一次性培养在有限容积的培养容器中，加入定量培养液，接入藻种，藻细胞生长繁殖达到较高的密度时，不加入或不更换培养液，一次性全部收获或全部用于下一级接种的培养方式。3.6一级培养、二级培养和三级培养一级培养（小型培养）：目的是保种和供应藻种。二级培养（中继培养）：目的是扩种，以满足生产性大量培养的需要。三级培养（生产性培养）：目的是大量培养以供给饵料。4水质条件和设施设备4.1水质条件应符合GB11607和NY5052要求。4.2设施设备4.2.1室外海水处理设施室外海水处理主要设施包括蓄水池、沉淀池、过滤设备、抽水泵及输水管道。4.2.2清洗消毒间用于清洗、消毒培养容器及消毒海水的操作空间。配有水槽、自来水、三角烧瓶、培养容器放置架、电炉或煤气灶等。4.2.3藻种间进行营养液配制及一级藻种培养的空间。要求光线充足，配有显微镜、药品柜、冷藏柜、有关化学试剂和药品、天平、三角烧瓶（容积一般为5000mL）、藻种培养架（或藻种摇床）、控温设施等。4.2.4饵料培养间用于二级培养和三级培养的空间，要求光线充足、通风条件好。配有化学试剂和药品、天平、量筒、称量操作台、温度计、消毒盆、耐酸碱手套及处理水池、培养池、输水、控温、调光设施，饵料培养间规模应根据育苗养殖水体而定。二级培养采用50000mL～100000mL光生物反应器或容量较大且透光较好的玻璃瓶、聚乙烯桶、塑料袋等容器。三级培养采用培养池，深度一般0.8m～1.0m，容积5m3～20m3；培养池应设有排污阀，配有搅拌耙。5消毒方法5.1消毒用药品消毒用药品应符合NY5071要求。DB21/T2280—201435.2一级培养用海水及容器的消毒将适量海水注入三角烧瓶，然后用淡水清洗瓶口及外壁，擦干瓶底水珠，置于电炉或燃气灶上煮沸5min，再用无菌纸盖和橡皮套封口，冷却至室温后使用。5.3二级培养用海水及容器的消毒5.3.1二级培养用海水的消毒采用烧瓶、搪瓷桶、专用海水消毒炉等将海水煮沸5min消毒，冷却至室温后使用。5.3.2二级培养容器的消毒培养容器及搅拌耙可于4﹪～8﹪的稀盐酸（37﹪浓盐酸稀释5～10倍）中浸泡2h以上，倒净酸水，用煮沸并冷却至60℃以下的水冲洗2遍，冷却后使用。5.4三级培养用海水及培养池的消毒5.4.1三级培养用海水的消毒按1m3海水加入含20mg～40mg有效氯的次氯酸钠液消毒处理12h～24h，然后按1m3加入25g～55g硫代硫酸钠还原，并用碘化钾淀粉试剂（配制与余氯检测见附录A）或碘化钾淀粉试纸测试，无余氯后才可使用。用于还原余氯的硫代硫酸钠量随次氯酸钠有效氯的变化而定，应适量。5.4.2三级培养池的消毒用含有效氯0.5﹪～1﹪的次氯酸钠液稀释液均匀地抹洗培养池池壁、池底及搅拌耙2遍，消毒2h以上，再用去除余氯的三级海水冲洗后即可使用。也可直接用未还原的三级消毒处理水（处理方法见5.4.1）浸泡消毒6h～24h。5.5其它消毒——温度计、称量用天平、药匙等可采用70%～75%酒精消毒。——一级、二级培养时量取营养盐母液用的刻度吸管可用淡水煮沸10min消毒。——操作人员日常洗手、操作台、培养架等可用0.05﹪～0.1﹪的苯扎溴铵溶液消毒。——水泵及水管可用未还原的三级消毒处理水在水泵及水管内循环5min～10min，然后停留6h～24h消毒。——耐酸碱手套表面、水桶、水舀等可用4﹪～8﹪的稀盐酸或含有效氯0.5﹪～1﹪的次氯酸钠液稀释液进行消毒，但盐酸与次氯酸钠不可同时使用。6培养液的配制6.1培养用药品培养用药品应符合NY5071要求。6.2一级、二级培养液配制6.2.1要求——所用药品和试剂标准应不低于化学纯。DB21/T2280—20144——配制全过程应在洁净操作间内完成，保证无污染。——配制好的母液应遮光冷藏保存。6.2.2配制方法按附录B扁藻培养液配方将营养盐成分（包括柠檬酸铁、磷酸二氢钾、尿素、硝酸钠）及维生素成分（包括维生素B1和维生素B12）用蒸馏水或纯净水各配成1000倍的母液，使用时按每升消毒海水添加1mL营养盐母液+1mL维生素母液而配成一、二级培养液。6.3三级培养液配制6.3.1要求——所用药品可用无污染的农用化肥替代。——配制全过程应认真消毒，保证无污染。6.3.2配制方法按附录B扁藻培养液配方直接称量营养盐、维生素，投入去除余氯的三级海水中，溶解搅匀即可。7藻种来源7.1藻种引入——从海洋微藻专业保种单位引入。——贝类育苗用藻种应在需用饵料的2～3个月前引入，其他水产养殖用藻种根据实际情况而定。——引种数量按扁藻每7d成倍增加的速度，根据水产养殖水体大小、饵料需要量等推算确定。7.2藻种提纯7.2.1提纯方法在适量的藻种培养液中加入1%～1.5%琼脂，加热溶化、灭菌，无菌条件下倒平板，冷却后用无菌接种环或接种棒将少量藻液在固体培养基表面划线，按附录C条件培养10d～20d，在无菌操作台上用解剖镜，选具有纯种特征、独立、无污染的藻落，用无菌牙签或接种针将其挑入适量培养液中培养。7.2.2提纯次数藻种每年应至少提纯1次。8培养方法8.1一级藻种培养8.1.1培养方式封闭式单种培养。8.1.2培养方法——按5.2方法消毒三角烧瓶和适量海水，冷却至室温使用。DB21/T2280—20145——按6.2.2方法配制培养液。——将藻种与培养液按2:1～1：1比例接种。——经过5d～15d的培养后，藻液颜色较深、密度较大时应及时添加新的培养液或及时分瓶培养。8.1.3要求扁藻培养应在其最适生态条件(见附录C)下培养；操作过程中应认真消毒，确保无污染。8.2二级藻种培养8.2.1培养方式开放式单种培养。8.2.2培养方法——按5.2方法消毒海水、培养容器及搅拌耙——按6.2.2方法配制培养液。——将一级藻种与培养液按1:2～1:5比例接种，隔日视生长情况及时添加培养液进行培养。8.2.3要求培养条件应符合附录C要求，搅拌耙为每个培养池专用，未经消毒不可混用。8.3三级培养8.3.1培养方式开放式单种培养。8.3.2培养方法——按5.4方法消毒处理并还原海水、消毒三级培养池及搅拌耙。——按6.3.2方法配制三级培养液。——用消毒过的水泵或专用输水管道将培养液注入消毒好的三级培养池中(泡池消毒的可在原池直接还原并配成培养液使用)。——将二级藻种与培养液按1:5～1:20比例接种于三级培养池中培养。——接种数日后，当藻液颜色明显变深（藻细胞密度≥50×104cell/mL），经镜检无敌害生物污染时，应及时添加新的培养液。8.3.3要求——接种时应镜检二级藻种，无污染的才可用于接种。——应在上午进行接种操作。——贝类育苗中初次接种时间应比预计投饵时间提前15～20d。——结合养殖动物的饵料需要情况及时接新藻种。——扁藻培养应在其最适生态条件下进行；操作过程中应认真消毒，确保无污染。9日常管理9.1一级、二级培养的日常管理DB21/T2280—201469.1.1搅拌对于无充气设施的培养容器，可通过摇瓶或搅拌等方法使容器内藻液充分混合，每日早、中、晚摇动或搅拌各1次。9.1.2温度调节定时检查调节温度，保持在最适范围内。9.1.3调节光照根据照度变化采用白布帘、人工光源等调节光照，使其在最适范围内。防止阳光直射及光照太弱，经常将强光照区及弱光照区的藻种调换位置。9.1.4调节酸碱度及时对pH值偏高的藻液进行调节，使pH值在7～8之间。9.1.5镜检与观察每日观察藻液，正常的藻液应沉淀较少、颜色每日变深、有明显聚集现象，发现异常，应及时镜检，发现混种或被敌害生物等污染的藻液应弃掉，并及时再接种培养。若无污染，按附录C条件调整温度、光照、pH值及营养，增加摇瓶或搅拌次数。9.2三级培养的日常管理9.2.1搅拌每日用搅拌耙搅拌培养池内藻液3～4次，要求搅拌彻底又要避免藻液溅入邻池。9.2.2温度调节定时检查藻液温度，必要时可用调节室温或直接调节藻液温度等方法，使其保持在最适范围内。9.2.3调节光照在光照过强时用白布帘等调节，使其尽量保持在最适范围内。9.2.4观察每日肉眼观察藻液，环境适宜情况下扁藻细胞上浮于表层，对上浮不好的的藻液应弃掉并及时接新种培养，补充空缺。9.2.5镜检——每日镜检扁藻生长繁殖情况及敌害生物污染等。如有大量敌害生物污染的，立即弃掉并及时接新种重新培养。——选择扩大培养藻液：新接藻种（接种后3d～7d）、镜检无敌害生物污染的主要用于扩种，即继续添加培养液进行扩大培养。——选择投饵藻液：三级培养池培养的新鲜藻液、细胞密度≥60×104cell/mL、镜检无污染的用于投饵，宜撇取上层藻液使用。老化藻液特别是超过15d的宜弃掉。——含有敌害生物藻液的处理：如果饵料供应紧张，可对颜色、密度正常，但镜检有少量敌害生物污染的三级藻液进行处理（处理方法见10.2），杀灭敌害生物，待藻细胞恢复后再添加培养液培养。DB21/T2280—201479.2.6记录每日记录镜检结果及接种、扩种、投饵等情况。10敌害生物的防治10.1敌害生物的预防——培养过程中，对原生动物等敌害生物应以预防为主。——各环节应严格操作，认真消毒，确保一、二级藻种无污染；确保整个三级培养无人为操作污染。——对扁藻的三级接种应有计划进行，适时新接藻种。——增加一级、二级藻种数量及密度，加大三级接种时藻液密度。——在保证饵料能正常供应的前提下，及时将老化的藻液弃掉。——三级培养应每日镜检，发现情况，及时处理。10.2敌害生物的处理方法一般的敌害生物污染可用酸化处理法，通常傍晚进行酸化。用盐酸（盐酸与淡水比例为1：1～1：10）使藻液pH值降至3～4,0.5h～2h后敌害生物可被杀死。然后用NaOH水溶液中和，使pH值恢复至7.5～8.5，一般经过12h～18h藻细胞能恢复正常，此时可以再添加培养液继续培养。DB21/T2280—20148AA附录A（资料性附录）碘化钾淀粉试剂的配制及余氯检测方法试剂配制：称取1g淀粉至200mL蒸馏水或纯净水中，加热并不断搅拌至液体澄清，冷却后加入2g碘化钾摇匀。此试剂应避光低温保存。余氯检测：取被检测海水10mL～50mL，滴入几滴碘化钾淀粉试剂，若被检测海水不变色，则无余氯；若被检测海水变蓝色,则