DB32∕T 2385-2013 梨果实主要风味品质的测定——HPLC 法

ICS67.080.01B31备案号：41080-2014DB32江苏省地方标准DB32/T2385—2013梨果实主要风味品质的测定——HPLC法HPLCAnalysisRegulationforDeterminationofMainFlavorQualityinPearFruit2013–12–30发布2013–01–20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2385—2013I前言为了更方便、更有效地检测梨果实主要风味指标，为评价不同梨果实风味品质提供参考依据，特制订本标准。本标准编写格式按GB/T1.1-2000《标准化工作导则第一部分标准的机构和编写的规则》和GB/T1.2-2002《标准化工作导则第2部分标准中规范性技术要素内容的确定方法》的规定编写。本标准由南京农业大学提出。本标准由南京农业大学园艺学院负责起草。本标准主要起草人：张绍铃、陶书田、齐开杰、吴俊、高永彬、吴巨友、谢智华、李梦。DB32/T2385—20131梨果实主要风味品质的测定--HPLC法1范围本标准规定了梨果实可溶性糖、有机酸及维生素C（Vc）等主要风味指标的检测技术。本标准适用于梨果实可溶性糖、有机酸及Vc的测定。2原理液氮研磨梨果实样品，可以使样品磨得更细、更充分，使提取率增加。37℃恒温超声波处理能充分提取梨果实可溶性糖和有机酸；超声波冰浴浸提可充分提取果实中Vc。高效液相色谱（HPLC）准确、可靠测定梨果实可溶性糖、有机酸及Vc等成分。3试剂果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、苹果酸、柠檬酸、莽草酸、奎宁酸、琥珀酸、草酸及维生素C均为色谱纯；其余化学试剂为分析纯；溶液配制采用超纯水（18.2MΩ·cm）。3.120mmol/L磷酸氢二钠缓冲液：称取2.400g磷酸二氢钠，溶解于超纯水，用磷酸调配pH2.6，用容量瓶定容至1L。3.22%的甲醇：20ml甲醇溶于980ml的20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液。3.35%的甲醇：50ml甲醇溶于950ml的20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液。3.480%的甲醇：取80ml甲醇于100ml容量瓶中，加超纯水定容至100ml。3.52%偏磷酸缓冲液：称取2.000g偏磷酸结晶，用超纯水定容至1L。4仪器4.1冰箱：温度可调至-16℃～-20℃。4.2研钵。4.3天平：精度分别为0.001g和0.0001g。4.4Milli-Q超纯水系统。4.5Waters1525液相色谱仪。4.5.1TransgenomicCOREGET-87碳水化合物柱。DB32/T2385—201324.5.2TransgenomicCARBSepCoregel87Ccartridge保护柱。4.5.3AgilentZorbaxrSB-Aq柱（4.6mm×250mm，5μm）。4.5.4Waters2414示差折光检测器。4.5.5Waters2487紫外检测器。4.6RE-3000真空旋转蒸发器。4.7高速冷冻离心机。4.8恒温水浴锅。4.9制冰机。5分析步骤5.1试样制备取成熟梨果实10～20个（小型果可适当增加果个数），去除果皮和果核，将果肉切成约1cm3的块，混匀。5.2可溶性糖、有机酸及维生素C提取5.2.1可溶性糖和有机酸的提取：取一定量的果肉，用液氮磨成粉，准确称取2g粉末状的果肉，加入提取液（80%的乙醇溶液），37℃水浴加热30min，超声波提取15min，12000g×15min×4℃条件离心，将上清转移至25ml容量瓶中，重复提取三次，定容，然后取2ml用旋转蒸发仪蒸干，再用超纯水定容1ml，再经过C18SPE柱和0.45μmSep-Pak微孔滤膜过滤。5.2.2维生素C的提取：取一定量的梨果肉，经液氮磨成粉，准确称取1g粉状果肉，用5ml0.2%的偏磷酸冰浴超声波浸提15min，12000g×15min×4℃条件离心，取上清定容至10ml，取1ml经0.45μmSep-Pak微孔滤膜过滤。5.3测定采用高效液相色谱（HPLC）对可溶性糖、有机酸及维生素C进行测定。5.3.1可溶性糖的测定：采用TransgenomicCOREGET-87碳水化合物柱，外加TransgenomicCARBSepCoregel87Ccartridge保护柱。柱温：85℃，参比池温度：35℃；流速：0.8ml/min；Waters2414示差折光检测器；流动相：脱水后的超纯水。每次进样体积为5μl。5.3.2有机酸的测定：色谱柱为AgilentZorbaxrSB-Aq柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为2%的甲醇（20ml甲醇溶于980ml的20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH2.6）；流速为0.7ml/min，柱温：35℃；检测器类型：Waters2487紫外检测器，波长210nm，进样量为5μl。5.3.3维生素C的测定：色谱柱为AgilentZorbaxrSB-Aq柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为5%的甲醇（50ml甲醇溶于950ml的20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH2.6）；流速为0.8ml/min，柱温：30℃；检测器类型：Waters2487紫外检测器，波长245nm，进样量为5μl。DB32/T2385—201335.3.4标曲的制作5.3.4.1可溶性糖标准曲线：根据果实中各成分含量，准确称取蔗糖50.00mg、葡萄糖100.00mg、果糖200.00mg、山梨醇100.00mg溶于25ml容量瓶中，用真空抽滤过的超纯水溶解并定容，分别取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、4ml于10ml容量瓶中，用超纯水定容，再经过C18SPE柱和0.45μmSep-Pak微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。根据六个浓度梯度色谱图，用液相色谱工作站，建立标准曲线及相关系数等指标。5.3.4.2有机酸标准曲线：根据果实中各成分含量，准确称取苹果酸50mg、柠檬酸50mg、奎尼酸40mg、莽草酸10mg、琥珀酸50mg、草酸30mg于5ml容量瓶中，用20mmol/L磷酸氢二钠溶液溶解并定容，分别取0.25ml、0.5ml、0.75ml、1.00ml、2.00ml于5ml容量瓶中，用20mmol/L磷酸氢二钠溶液定容，经过C18SPE柱和0.45μmSep-Pak微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。根据六个浓度梯度色谱图，用液相色谱工作站，建立标准曲线及相关系数等指标。5.3.4.3维生素C标准曲线：根据果实中各成分含量，准确称取25mg维生素C于5ml容量瓶中用20mmol/L磷酸氢二钠溶液溶解并定容，分别取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml于5ml容量瓶中，用20mmol/L磷酸氢二钠溶液定容，经过C18SPE柱和0.45μmSep-Pak微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。根据六个浓度梯度色谱图，用液相色谱工作站，建立标准曲线及相关系数等指标。6结果计算按下式计算试料中可溶性糖、有机酸、维生素C的含量：21mm=X式中：X—果肉中的可溶性糖、有机酸及维生素C的含量，单位为毫克每克鲜重（mg/gFW）；m1—可溶性糖、有机酸及维生素C的含量，单位为毫克（mg）；m2—称取果实鲜重，单位为克（g）；FW—鲜重（FreshWeight）计算结果表示到小数点后两位。7允许差同一人员对同一试样同时或连续两次测定结果之间差异不超过平均值的5％。_________________________________