DB32∕T 2607-2013 猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪A 群轮状病毒检测技术多重

ICS65.020.30B22备案号：40493-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2607-2013猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪A群轮状病毒检测技术多重RT-PCR法MethodofaMultiplexReverseTranscription-PCRforDetectionofPorcineEpidemicDiarrheaVirus，PorcineTransmissibleGastroenteritisVirusandPorcineGroupARotavirus2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2607-2013前言为规范猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪轮状病毒分子生物学检测技术，提高猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪轮状病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：郭容利、何孔旺、倪艳秀、俞正玉、茅爱华、李彬、温立斌、王小敏。DB32/T2607-20131猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪A群轮状病毒检测技术多重RT-PCR法1范围本标准规定了猪流行性腹泻，猪传染性胃肠炎与猪A群轮状病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎与猪A群轮状病毒的RT-PCR检测。本标准适用于猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎与猪A群轮状病毒实验室诊断、流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548—2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541—2002动物疫病实验室检验采样方法3主要试剂3.1DNAMarkerDL-20003.3TRIzol3.4DEPC3.5小量胶回收试剂盒3.6氯仿3.7异丙醇3.8无水乙醇3.9反转录试剂盒3.10HSTMMix4引物根据GenBank上公布的PEDV核蛋白N基因序列，TGEV糖膜蛋白M基因序列，猪A群轮状病毒（PARV）内衣壳蛋白VP6基因序列，分别在其保守区设计一对特异性引物见表1。表1引物序列表引物引物序列PCR产物长度bp退火温度℃PEDVN15’-gcatttctactacctcggaa-3’75054PEDVN25’-gcgatctgagcatagcctga-3’TGEVM15’-gcgtctgattgtgagtcatg-3’54454TGEVM25’-aatagtcctgctgggtaatg-3’PRVP615’-cagcgtactggattcgtgtt-3’27554PRVP625’-tcttgggaaactgaacctct-3’5样品DB32/T2607-201325.1阳性病毒样品的取样5.1.1PEDVCV777疫苗毒株，VERO细胞培养。5.1.2TGEVJSXB2010细胞毒，ST细胞培养。5.1.3PARVNan86细胞毒，Marck145细胞培养。上述三种病毒按107TCID50/ML等量混合后备用做阳性样品。上述三种细胞加培养液冻融三次后等量混合后备用做阴性对照。5.2粪便与组织样品的处理按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，采集腹泻猪的粪便或肠组织样品，在粪便或研磨好的小肠组织中按1：10加入DEPC水，剧烈震荡使其混和均匀，5000rpm，离心20min，取上清于-20℃备用。反复冻融三次后，以5000rpm，离心20min，取上清。对每个样品进行编号标记。另外，按照GB16548—2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理待检粪便或组织样品。5.3细胞培养物样品的处理细胞培养物反复冻融三次后，以12000rpm，离心20min，取上清。阴阳性细胞培养物对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6RNA的提取在被检样品与200µL上清中加入TRIzol800µL，振荡混匀后，室温放置5min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置10min，4℃12000rpm，离心10min，取上清，加入0.5mL异丙醇，混匀，-20℃放置2h以上，4℃12000rpm离心15min，去上清，沉淀用1ml75%的无RNA酶的乙醇洗涤，4℃7500rpm离心5min，去上清，室温干燥RNA沉淀20min，加入DEPC水20µL，使充分溶解，-20℃冻存备用。7RT-PCR7.1反转录反应表2反转录反应组分体积10X反转录缓冲液2uLdNTP（10mM）2uLMgCl2,（25mM）3uLRNasin0.5uLAMV反转录酶0.5uL随机引物1.0uLRNA2uL加无RNA酶的ddH2O（DEPC水）9uL终体积为20uL瞬间离心混匀，25℃反应15min，42℃孵育60min，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，cDNA产物于-20℃保存备用。7.2PCR反应表3PCR反应组分体积cDNA2uLPEDVN1/PEDVN2（20pmol·uL-1）0.5uL/0.5uLTGEVM1/TGEVM2（20pmol·uL-1）0.5uL/0.5uLPRVP61/PRVP62（20pmol·uL-1）0.25uL/0.25uL2×HSTMMix12.5uLddH2O（DEPC水）补足至25uLDB32/T2607-20133表4反应条件温度时间备注95℃3min95℃30sec35Cycles54℃30sec72℃45sec72℃10min4℃保存7.3结果观察将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min，紫外灯下观察结果,并进行拍照。7.4结果判定以阳性病毒作为阳性对照,以培养病毒细胞作为阴性对照，灭菌水作空白对照，做RT-PCR，所有样品同时电泳。阳性对照有三条750bp、544bp、275bp左右的目的条带，分别对应PEDV或TGEV或PARV，阴性对照、空白对照无相应的目的条带的情况下，检测样品出现与阳性对照相同目的条带的判为阳性，即该粪便为PEDV或TGEV或PARV核酸阳性；检测样品未出现与阳性对照相同目的条带的判为阴性。即该粪便为PEDV、TGEV和PARV核酸阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。