DB11 T 376-2006 养殖鱼类病害防疫检疫技术规范

ICS65.150B50备案号：19167-2006北京市地方标准DBDB11/T376—2006养殖鱼类病害防疫检疫技术规范Rulesofepidemicquarantiningandpreventionforfamiliardiseaseofculturedfish2006-07-25发布2006-10-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T376—2006I前言本标准为常见鱼病防疫检疫技术操作规程。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准起草单位：北京市农业局水产办公室。本标准主要起草人：李继勋、杨华莲。DB11/T376—20061养殖鱼类病害防疫检疫技术规范1范围本标准规定了常见养殖鱼类的病害防疫检疫技术操作规范。本标准适用于北京地区淡水养殖鱼类疾病的防疫检疫和管理。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBll607渔业水质标准GB/T15805.1-1995淡水鱼类检疫方法第一部分GB/T18407.4-2001农产品安全质量无公害水产品产地环境要求NY5070-2002无公害食品水产品中渔药残留限量NY5072-2002无公害食品渔用配合饲料安全限量NY5171-2002无公害食品渔用药物使用准则DB11/T196-2003常见鱼病防治技术操作规程3防疫调查3.1养殖的环境调查3.1.1周围环境根据GB/T18407.4要求的各项指标进行调查。3.1.2养殖水源调查养殖用水来源和进排水。根据GB11607各项水质指标调查水质的情况。3.1.3养殖水体调查养殖水体形状、面积、水深、底质及水化因子情况。3.2养鱼史调查调查养殖鱼类发生鱼病的病原类型、发生频率、药物的使用情况（包括药物种类、成分、用量和施用次数）。调查放养鱼苗、鱼种产地病史、检疫和药物使用情况。3.3水质监测3.3.1气温和水温采用水银温度计、酒精摄氏温度计、电子仪器测量，测量时要注明当天的气象情况。3.3.2水色和透明度透明度采用透明度板进行测量，通过目测观察养殖水体的水色以判断浮游生物的种类和数量。3.3.3水体pH值采用PH试纸、比色测定计、电子酸度计进行测定。3.3.4溶氧使用碘量法测定养殖水体的溶氧量。3.4化学物质测定根据GB11607要求的水质指标和方法进行分析。3.5池塘清整方法3.5.1清塘方法DB11/T376—20062调查清塘消毒方法（是干塘清塘消毒法或带水清塘消毒法）和清塘程度，包括淤泥的清理程度、排水、除杂以及塘基修复情况。3.5.2清塘消毒药物根据NY5171提供的药物进行清塘。调查内容包括清塘消毒时间、各种药剂名称、用量、效果及消毒时的操作方法的调查。3.6饲养管理情况调查包括饵料来源、种类、投喂方法、水质管理和平时疾病预防方法等内容。4病原体的检查首先确定检测的鱼品种名，检测器官部位、病变程度，所取标本的情况，再通过目检、显微镜检查、病毒学检测、细菌学检测检查发病原因和初步确定病原体的种类。4.1检测及分类4.1.1目检根据症状通过目检法初步判断病因和原病种类。主要有寄生虫病、水霉、原生动物、蠕虫等；根据病鱼的外表反应初步判断和辨别病毒和细菌性病原体。4.1.2镜检采用放大镜、解剖镜、光学显微镜等检查法。4.1.3分离、培纯以及感染试验采用镜检方法对微生物性病原、病毒、细菌进行检测，如对微生物性病原、病毒、细菌的细胞形态、培养特征、生理生化反应等进行观察、测定，需要进一步进行分离、培纯以及感染试验。4.2寄生虫类病原体检查对比较大的寄生虫性病原体，宜用放大倍数低的显微镜或双筒解剖镜检查。4.2.1玻片下观察把从器官或组织上分离出的较大的寄生虫直接放在小玻璃皿或玻片上观察，对较小的寄生虫要把寄主的器官组织或内含物压成薄层后进行观察。4.2.2镜检4.2.2.1检鳃从每一侧鳃的第一片鳃片接近两端的位置取鳃组织。4.2.2.2检口腔先用目检方法观察鱼体表面确定有无吸虫的大胞囊、锚头藻等，再用镊子刮取上下颌少许粘液进行镜检。4.2.2.3检体腔将鱼腹剖开，将器官暴露，观察脂肪组织、肝、胆囊、脾等有无肉眼可见的病原体。如发现有白点，可能是粘孢子虫或微孢子虫。还可发现线虫、绦虫、棘头虫等成虫和囊蚴。目检完毕后，把腹腔液用吸管吸出，置于培养皿里进行检查。4.2.2.4检脂肪组织通过目检胃肠外壁的脂肪组织，如果发现白点，肉眼无法判断时，可用镊子取出，压片进行镜检。4.2.2.5检胃肠先把肠外壁的脂肪组织剔净，然后在前肠(胃)、中肠和后肠三段上各取少许，滴上生理盐水进行镜检。对寄生部位比较固定的寄生虫，如通常寄生在后肠近肛门的位置的六鞭毛虫、变形虫、肠袋虫等，通常寄生在前肠(胃)或中肠的复殖吸虫、绦虫、线虫和棘头虫等。4.2.2.6检肝和脾先目检肝、脾外表颜色和病灶，有无溃烂、病变、白点和肿瘤等。如有白点，可能是粘袍子虫或者微袍子虫、球虫。然后用镊子从肝、脾上取少许组织压片镜检。DB11/T376—200634.2.2.7检胆囊把胆囊完整取出后，放入培养皿中，先通过目检观察外表颜色和可疑的疾病症状，然后剪开，放出胆汁，取一部分胆囊壁放在载玻片上压片进行镜检。4.2.2.8检心脏用小剪刀剪开胸腔，取下心脏，并将心脏剪开，取一滴内含物，进行镜检，检查是否有锥体虫、隐鞭虫等。同时取心脏组织少许用玻片压展法进行镜检。4.2.2.9检鳔取鱼鳔时保持鳔的完整，观察其外表，然后剪开，检查有无复殖吸虫、线虫。同时取鳔组织少许用玻片压展法进行镜检。4.2.2.10检肾脏把整个肾脏完整地取出。检查方法同4.2.2.6。检查有无粘孢子虫、球虫、锥体虫、隐鞭虫，复殖吸虫、线虫等幼虫。4.2.2.11检性腺和膀胱将左右两个性腺完整取出，进行目检。没有膀胱的鱼，则检查输尿管。4.2.2.12检眼把完整的鱼眼睛放在玻皿或玻片上，剖开巩膜，放出玻璃体和水晶体，进行镜检，检查寄生在眼睛的吸虫幼虫。严重感染吸虫时，水晶体变白色，混浊不透明，致使鱼眼失明。4.2.2.13检脑按水平方向，从后向前，在后脑和眼睛之间剪开头盖骨上壁，即见到充满着淡灰色泡沫状的油脂物质，用吸管把它吸出，放在玻皿里，以备检查。吸净油脂物质后，灰白色的脑即显露出来，用剪刀把它完整地取出来检查。4.2.2.14检脊髓从头部与躯干交接处把脊柱骨剪断，再把身体的尾部与躯干交接处的脊柱骨也剪断，用镊子从前端的断口插入脊髓腔，把脊髓夹住，慢慢地把脊髓整条拉出来，然后检查。4.2.2.15检肌肉从身体的一侧面剖开一部分皮肤，用镊子把皮肤剥去，或用小棍棒(玻棒或竹棒)，象卷纸筒一样，慢慢地把皮肤卷剥。剥去皮肤后，肌肉即露出来，经目检后，再进行镜检。4.3原生动物病原体的计数原生动物不同种类个体大小差异大，除纤毛虫、毛管虫以显微镜低倍视野为单位之外，其他种类如鞭毛虫、变形虫、孢子虫均以显微镜的高倍视野为单位。寄生虫或病原体数量用“十”号表示，“十”表示有；“++”表示多；“+++”表示很多。必要时可用文字描述。具体表示法:在一个视野里，有（1-20）个虫体记“十”，（21-50）个虫体记“++”，51个虫体以上记“+++”。关于胞囊的计数则用文字说明。4.4单殖吸虫、线虫、绦虫、棘头虫、甲壳动物和软体动物幼虫的计数在50个以下均以数字说明，50个以上则说明估计数字或者部分器官里的虫体数。4.5检查时所用的显微镜的倍数显微镜倍数都应注明，低倍显微镜为10倍；高倍显微镜为10倍～40倍。微型病原体数量的计算，是以同一玻片中观察的平均数为准。5病原体的收集操作对需要通过详细观察其形态结构才能鉴定和需要进一步研究的病原体，应做好其标本的收集、固定和保存。5.1病毒DB11/T376—20064收集病毒性病原体标本，应在无菌操作下收集发病早期的病鱼带毒最多的组织器官，保证病毒不致灭活。5.1.1病毒材料的收集取出病变的器官组织置于无菌器皿中，然后置于50%的磷酸缓冲甘油中。注明收集地点、日期和寄主种类。实验室距现场较近，可以直接检测，若实验室距现场较远，需把病鱼或病鱼器官组织放入有冰块的保温瓶中，快速运往实验室。保存温度在-2O℃～50℃。5.1.2病毒的分离培养由于病毒只能在活的组织细胞中繁殖，鱼类病毒分离培养应通过组织培养。5.1.3病原悬液的制备将保存在50%缓冲甘油的标本(样品)，用无菌生理盐水冲洗3次，如是新鲜收集的器官组织材料，测量重量后，用剪刀剪碎，按样品重量加入适当比例的缓冲生理盐水(比例为1:10至1:20)，用匀浆器或乳钵将样品研成乳状，以3000转/min速度离心20min，吸取上清液，按体积1ml加入青霉素800国际单位、链霉素800μg，在30℃左右处理2h，然后于5℃保存备用。将离心后的上清液，经滤器过滤除菌，滤液保存备用。5.1.4鱼体造病感染采用注射或浸泡两种方法，同时设对照组观察。5.1.4.1注射感染将病原悬液配成一定浓度，从鱼体腹鳍基部进行腹腔注射，用量视鱼体的大小而定，通常每尾注射0.2ml～0.4ml。注射后放入水族箱中饲养，维持发病水温，观察发病情况。5.1.4.2浸泡感染将病原悬液和无氯自来水稀释成一定浓度，将健康鱼放入其中浸泡30min后，移至水族箱中饲养，维持发病水温，连续观察鱼的发病情况。5.1.5细胞培养与感染采取组织培养的方法进行病毒的分离、培养，制备纯净的病毒抗原，通过血清学试验(如中和试验)与感染细胞的特异变化来进行病毒的鉴定和抗血清效价的滴定等。5.1.6原代细胞培养选择健康鱼，在无菌操作下解剖，取出组织，置于盛有EarIe氏平衡盐溶液的无菌培养皿中，用镊子小心除去附着的组织和血块，然后移入瓶中，用Earle氏液洗涤2次，将组织剪碎，成为约lmm大小的组织块，再用Earle氏液洗1次，加入相当于组织量10倍(约1份组织加入9份胰酶)的25%的胰酶，在25℃消化20min～30min，消化完毕，弃去胰酶液，用Earle氏液清洗2次，然后加入Eagle's生长液(Eagle's液加入10%小牛血清、青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml，用5%NaHCO3，调节pH7.2～7.4)，用吸管反复吸吹，以助细胞分散，静置片刻，让没有分散的大颗粒沉下，然后吸取上层的细胞悬液，稀释成100万单位/ml的浓度，接种入培养瓶(若采用青霉素瓶作培养瓶，则每瓶分装1毫升即可)，盖紧瓶塞，置温箱内(温水性鱼类可在22℃～28℃)培养。每隔3d～4d更换培养液1次，逐日在显微镜下观察细胞生长情况。Earle氏溶液配方见附录A。5.1.7病毒接种选取生长均匀的单层细胞培养物，在无菌操作下，吸出细胞瓶内旧的培养液，以Earle氏液清洗细胞1次，然后接种入上述制备好的病原悬液(青霉素瓶可接种0.2ml～0.4ml)，在28℃吸附30min～60min，然后弃去瓶内的病原悬液，加入与原来培养液等体积的维持液(即Eagle液含2%～6%小牛血清、青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml，pH7.2～7.4)，置于28℃的条件下培养，在显微镜下逐日观察细胞病变。不同病毒应按照不同的病毒接种方法进行。5.1.8病毒株的保存5.1.8.1低温冷冻保存DB11/T376—20065若在短期内使用,应将含有病毒的细胞培养液或含有病毒的组织器官暂时保存于-20℃～-80℃的低温冰箱或液氮中。材料应贴好标签，注明毒株名称、代数及日期。5.1.8.2真空干燥保存长期保存病毒活力可采用真空干燥方法。但应使用适宜的保护剂制备病毒的悬液，保护剂有正常灭活血清、卵白和卵黄、蔗糖饱和液等。5.2细菌5.2.1细菌类病原体标本的收集取得病鱼标本后，应立即送往实验室进行分离。在野外调查的流动条件下，或离实验室较远，可采用如下方法将病鱼标本暂时保存。——冰块法将病鱼(要取未死或刚死的病鱼)放入盛有冰块的瓶里，然后送实验室进行病原菌分离。——棉拭子法如果是血液或分泌物