（天津专用）2020高考生物二轮复习 第16讲 基因工程课件

第16讲基因工程-2-一、基因工程1.基因工程的三种工具限制酶DNA连接酶载体作用切割目的基因和载体拼接DNA片段,形成重组DNA携带目的基因进入受体细胞作用部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键—作用特点(条件)①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列②在特定位点上切割①E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端②T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制②有一个至多个限制酶切割位点③具有特殊的标记基因-3-限制酶DNA连接酶载体常用类型EcoRⅠ限制酶、SmaⅠ限制酶E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等-4-2.PCR技术(1)PCR的过程温度控制目的预变性90℃以上增加大分子模板DNA彻底变性的概率循环变性↓复性↓延伸90℃以上,如95℃使双链DNA解聚为单链55℃两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合72℃在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链-5-(2)PCR与DNA复制的比较PCRDNA复制不同点场所体外细胞内能量不需ATP提供能量需ATP提供能量酶耐高温的TaqDNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等特点体外迅速扩增边解旋边复制,半保留复制循环次数三十多次受生物体自身控制缓冲液需要不需要设备严格控制温度变化的温控设备无-6-PCRDNA复制相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA引物都需要与模板相结合的引物-7-3.基因工程的操作程序(1)目的基因的获取①从基因文库中获取。②利用PCR技术扩增:其实质是在体外对目的基因进行大量复制。③用化学方法人工合成a.对于核苷酸序列已知的直接人工合成。b.可通过反转录法获取,即mRNA单链DNA双链DNA。-8-(2)基因表达载体的构建①基因表达载体的组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因。②基因表达载体的构建方法-9-(3)将目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法(用Ca2+处理)受体细胞类型受精卵、体细胞受精卵原核细胞-10-(4)目的基因的检测和鉴定类型检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否整合到受体细胞染色体的DNA上DNA分子杂交(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术(DNA和mRNA之间)第三步目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交个体水平鉴定根据目的基因表达出的性状判断,包括做抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的强弱;对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较,以确定功能是否相同-11-二、蛋白质工程1.蛋白质工程-12-2.蛋白质工程与基因工程的比较蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质一般只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造-13-三、DNA的粗提取与鉴定1.DNA的粗提取(1)材料的选取:选用DNA含量相对较高的生物组织。(2)破碎细胞①动物细胞:吸水破裂。②植物细胞:加入洗涤剂、食盐后研磨。(3)除去杂质的方法①利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同,通过控制NaCl溶液的浓度除去杂质。②利用酶的专一性,直接在滤液中加入嫩肉粉,反应10~15min,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质,但不会破坏DNA。③利用DNA对高温的耐受性,将滤液放在60~75℃的恒温水浴箱中保温10~15min,使蛋白质变性沉淀,而DNA分子未变性。-14-(4)DNA的析出:向处理后的滤液中加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3min,溶液中会出现白色丝状物,用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物。2.DNA的鉴定在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色。-15-考点一考点二考点三基因工程考向1基因工程的工具及PCR技术1.(2019全国Ⅰ理综)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是。-16-考点一考点二考点三答案:(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至90~95℃氢键(3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活-17-考点一考点二考点三2.下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题。限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ识别序列及切割位点-18-考点一考点二考点三-19-考点一考点二考点三(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加。平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3AⅠ切割图1质粒,最多可以获得种大小不同的DNA片段。-20-考点一考点二考点三答案:(1)BclⅠ和HindⅢDNA连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)TGATCCACTAGGGGATCACCTAGT都不能(4)7-21-考点一考点二考点三3.(2017江苏)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下。请回答下列问题。-22-考点一考点二考点三(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得,用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)。为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间,以防止引物自连。(3)图中步骤1代表,步骤2代表复性,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的复性温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有__(填序号:①升高复性温度②降低复性温度③重新设计引物)。-23-考点一考点二考点三答案:(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶切割碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5)②③-24-考点一考点二考点三通技法载体中限制酶及其切割位点的分析(1)一个至多个限制酶切割位点:作为载体必须具有一个至多个限制酶切割位点,以便与外源基因连接。(2)每种酶的切割位点最好只有一个。因为每种限制酶只能识别单一切割位点,若载体上有一个以上的该酶切割位点,则切割重组后可能丢失某些片段。若丢失的片段含复制原点区,则形成的载体进入受体细胞后不能自主复制。若一个载体只有某种限制酶的一个切割位点,则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。-25-考点一考点二考点三考向2基因工程的操作程序4.(2019天津理综)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。-26-考点一考点二考点三据图回答下列问题。(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中(单选)。A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录(2)从水稻体细胞或中提取总RNA,构建文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。(3)在过程①②转化筛选时,过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程在培养基中应加入卡那霉素。-27-考点一考点二考点三(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是(多选)。A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明。答案:(1)D(2)精子cDNA(3)②①(4)BCD(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚-28-考点一考点二考点三5.(2018全国Ⅱ理综)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达,某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。-29-考点一考点二考点三回答下列问题。(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是,使用这两种酶进行酶切是为了保证,也是为了保证。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了和过程。(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的移入牛的中,体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。-30-考点一考点二考点三答案:(1)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA-31-考点一考点二考点三6.菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花,培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程,请据图回答下列问题。注卡那霉素抗性基因(kanR)作为标记基因,菊花叶片对卡那霉素高度敏感。-32-考点一考点二考点三(1)为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒,可用处理土壤农杆菌,使其处于,以便吸收重组质粒。(2)将重组质粒导入土壤农杆菌的目的是利用农杆菌能够的特点,使目的基因进入受体细胞中,并插入菊花细胞的上,最终形成转基因植株。(3)将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素和的培养基中,在适宜条件下进行培养,筛选转基因菊花。(4)用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时,需根据的核苷酸序列设计特异引物,以为模板进行第一轮扩增。-33-考点一考点二考点三(5)将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫,实验结果如下表所示。组别死亡率/%实验组转基因植株160.00转基因植株253.33对照组13.33①对照组应饲喂等量的。②据表分析,差异显著,说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。-34-考点一考点二考点三答案:(1)Ca2+(或CaCl2)感受态(2)感染菊花