PolyLea非脂质体转染试剂

PolyLea非脂质体转染试剂简介：外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。目前常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们容易透过细胞膜，其中阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，在体内它迅速被血清清除，会肺组织内累积诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。LeagenePolyLea非脂质体转染试剂(PolyLeaTransfectionReagent采用专利配方的阳离子聚合物为主要成分，其高度的分支结构确保了高正离子电荷密度，使得与带有负电荷的外源基因结合更有效，容易被细胞吸收，排斥少，因此能显著提高外源基因的转染效率，适合多种类型的细胞系，细胞存活率高，可以广泛用于瞬时转染和稳定转染。LeagenePolyLea非脂质体转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有较高的转染效率，较好的重复性，且操作简以及单细胞毒性较小，可用于贴壁细胞和悬浮细胞，与Lipofectamine®2000Reagent相似。该转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。组成：自备材料：1、胰蛋白酶消化液2、完全培养液和不完全培养液3、PBS操作步骤(仅供参考)：(一)DNA转染：1、(以12孔板为例)在转染前18～24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至12孔板中，并将细胞培养板置于CO2培养箱培养，待细胞密度达到即可进行转染。后续操作步骤均按12孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。2、在加入待转染的DNA之前2～4h，加入不含抗生素的完全培养液，置于CO2培养箱培编号名称CZ0004CZ0004CZ0004StoragePolyLea非脂质体转染试剂0.5ml1ml5×1ml4℃使用说明书1份养。也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素使某些细胞转染后出现一定的细胞毒性。3、配制转染工作液：取两个无菌离心管，分别加入不含抗生素和血清的培养液，取其中一离心管加入DNA，轻轻混匀；取另一离心管加入PolyLea非脂质体转染试剂，轻轻混匀。室温静置，将含有DNA的培养液用微量移液器轻轻加入含PolyLea非脂质体转染试剂的培养液中，轻轻吹打混匀，室温静置。4、将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于CO2培养箱中进行培养。5、培养后，更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞，推荐在转染更换培养液；对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染更换培养液。6、继续培养后，观察或收集细胞或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。不同细胞器皿转染时培养液、DNA、PolyLea非脂质体转染试剂用量表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish铺板培养液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml无血清培养液15μl25μl50μl100μl200μl500μlDNA0.2μg0.8μg1.6μg4μg8μg24μg无血清培养液15μl25μl50μl100μl200μl500μlPolyLea非脂质体转染试剂0.4μl1.6μl3.2μl8μl16μl48μl注意：对于12孔板中一个孔的细胞，PolyLea非脂质体转染试剂的用量可以在范围内进行适当调节，DNA用量建议，但也可在范围内进行适当调节。通常DNA用量(μg)和PolyLea非脂质体转染试剂(μl)用量比例为1:2~6，如有必要可在1:1~10的范围内优化转染效果。为了获得最佳的转染效果，不同的细胞类型和培养条件有所不同，可在上述推荐范围内自行优化转染条件。(二)siRNA转染：1、(以12孔板为例)在转染前用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至12孔板中，并将细胞培养板置于CO2培养箱培养，待细胞密度达到即可进行转染。后续操作步骤均按12孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。2、在加入待转染的siRNA之前2～4h，加入1ml不含抗生素的完全培养液，置于CO2培养箱培养。也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素使某些细胞转染后出现一定的细胞毒性。3、配制转染工作液：取两个无菌离心管，分别加入不含抗生素和血清的培养液，取其中一离心管加入siRNA，轻轻混匀；取另一离心管加入PolyLea非脂质体转染试剂，轻轻混匀。室温静置，将含有siRNA的培养液用微量移液器轻轻加入含PolyLea非脂质体转染试剂的培养液中，轻轻吹打混匀，室温静置。4、将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中，轻轻混匀后置于CO2培养箱中进行培养。5、培养后，更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞，推荐在转染4h更换培养液；对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6h更换培养液。6、继续培养后，观察或收集细胞。不同细胞器皿转染时培养液、siRNA、PolyLea非脂质体转染试剂用量表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish铺板培养液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml无血清培养液15μl25μl50μl100μl200μl500μlsiRNA5pmol20pmol40pmol100pmol200pmol600pmol无血清培养液15μl25μl50μl100μl200μl500μlPolyLea非脂质体转染试剂0.25μl1μl2μl5μl10μl30μl注意：对于12孔板中一个孔的细胞，PolyLea非脂质体转染试剂的用量可以在范围内进行适当调节，siRNA用量建议在范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和PolyLea非脂质体转染试剂(μl)用量比例，如有必要可以在10~40:1范围内优化转染效果。为了获得最佳的转染效果，不同的细胞类型和培养条件有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。siRNA的推荐浓度为，常用浓度范围为。对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的PolyLea非脂质体转染试剂和siRNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育后，按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。注意事项：1、注意无菌操作，尽量避免污染，2、使用高纯度DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，同时DNA不应含有蛋白和酚。3、影响转染效率的因素有很多，如细胞类型、细胞状态及密度、DNA/siRNA转染量、转染试剂与DNA/siRNA比例等，应该在具体实践中优化来确定最佳转染条件。4、为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染，转染前细胞必须处于良好的生长状态。5、为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒，OD260/OD280≥1.8。6、PolyLea非脂质体转染试剂不应Vortex或离心，宜缓慢晃动混匀。7、在体外细胞转染试验中，可通过预实验在PolyLea非脂质体转染试：DNA(µg)=2:1~6:1之间选择最佳的比例。8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。-20℃保存2年有效。相关：编号名称CS0001ACK红细胞裂解液(ACKLysisBuffer)DC0032Masson三色染色液DC0041天狼星红染色液DG0005糖原PAS染色液DM0002姬姆萨染色液(1:9)PS0013RIPA裂解液(强)PW0111SuperECLPlus超敏发光液TE0002碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP微板法)