基因功能分析的基本策略-硕士

基因功能分析的基本策略StrategyforGeneFunctionAnalysis郭睿山西医科大学生物化学与分子生物学教研室后基因组研究焦点：基因功能研究CentralDogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscriptionFactorsAlt.SplicingAlt.Poly-A,Alt.TranslatinStartCentralDogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscriptionFactorsTGSPTGSTGS:TranscriptionalGeneSilencingPTGS:PostTranscriptionalGeneSilencing反向遗传学——ReverseGeneticsGeneDNASequenceGeneDisruptionPhenotypeAnalysisFunctionDevelopmentPhysiologyCellBiologyGeneticallyLinkHomologousrecombinationOverexpressionAnti-senseRNAi抑制基因表达观察功能变化KnockOut法Antisense法Ribozyme法RNAi法RNA干扰技术基因敲除技术基因转染细胞模型转基因动物模型基因功能分析的基本策略将某一基因从动物基因组中剔除或将外源基因引入动物基因组产生经过基因工程修饰（改造）的动物实现在整体和细胞水平认识基因的功能第一节转基因技术transgenictechnology将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中通过外源基因与细胞染色体DNA之间随机发生重组将外源基因插入到受体细胞染色体DNA中转基因动物基因转染细胞模型转基因动物转基因动物模型实验步骤转基因载体的构建；将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞；将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内；对转基因动物进行鉴定。转基因载体结构基因报告基因增强子启动子受精全能性细胞注射植入假孕小鼠后代SouthernblotRT-PCRWesternblot转基因小鼠基因转染细胞模型实验步骤真核重组表达质粒的构建；在原核细胞中复制扩增和克隆化真核重组表达质粒；将重组表达质粒转染哺乳动物细胞；重组质粒转染细胞的克隆化筛选、保存；转染细胞表达目的蛋白、提取、鉴定。转染技术脂质体法脂质体法将待转染的DNA溶液与磷脂混合，形成脂质体结构，将脂质体悬液加入到细胞培养液中，与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质或细胞核内。电击法在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。显微注射法将外源DNA在显微操作系统的辅助下，直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。基因枪法将要转染的DNA吸附到高黏度的金属颗粒上，在加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的。磷酸钙法将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，使DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；加入贴壁培养的细胞中被吸收，实现转基因。瞬时转染：外源DNA不整合到宿主染色体中，可存在多个拷贝，能产生高水平的表达，但通常只持续几天。稳定转染：外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。外源DNA整合到染色体中的概率很小，通常需要通过一些选择性标记进行反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。第二节RNA干扰技术RNAInterference(RNAi)QuickTime?andaGIFdecompressorareneededtoseethispicture.加工dsRNA形成21-23nt小片段DicerRNAi的要素：DicerDicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNAsiRNA19ntduplex2nt3’overhangsRNA诱导沉默复合物RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅发生在与siRNA同源的部分。RNAi的要素：RISCRISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC复合物，降解目的mRNAdsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNARNAi机制DicerRISC碱基互补酶解RNA干扰实验的基本过程1.确定干扰靶点干涉靶点序列应具备的条件：①尽量避开蛋白结合位点；②一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征；③G＋C比比例为50%左右；④被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性；⑤通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列提供RNAi在线技术支持的公司（网站）2.将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进行BLAST比较3.制备siRNAsiRNA制备常用的五种方法：化学合成体外转录长片断dsRNAs经RNaseIII类降解siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAsPCR制备的siRNA表达框在细胞中表达化学合成质量高，高纯度，高成本适用于已经验证过抑制效率的靶点序列不适于筛选靶点序列体外转录成本适中，省时，适用于筛选靶点序列不适用于长期的研究或者针对某个特定靶点序列的大量研究长片断dsRNA酶解法dsRNA在体外被RnaseⅢ家族成员切割成siRNA不需要验证筛选多个靶点序列不适用于长期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAsAAACCAGCAGAACGTGTACGA载体介导的细胞内表达siRNA方法的特点操作简便，稳定性好siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株4.对目标RNA的干扰转染靶细胞对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Westernblot在蛋白质水平上进行监测RNAi实例(载体法)：Targetgene：c-myc查找靶基因mRNA利用网络在线支持，寻找siRNA序列根据查找的siRNA序列，合成长链oligo构建载体转染检测效应（包括干扰效应和生物学效应）2、、其它网站1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）目的基因mRNA获取：载体构建：dsDNA形成：退火载体的酶切和回收连接转化鉴定转染：瓶颈之一含有真核细胞筛选标志含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾(a)(b)24h48h00.20.40.60.812阴性对照组干扰组干扰组阴性对照组00.20.40.60.812阴性对照组干扰组1.00.80.60.40.20mRNA相对表达量00.20.40.60.8112系列1系列2c-actinPokemon500300500300(d)Pokemonβ-actin(a)Pokemon蛋白相对表达量00.20.40.60.812阴性对照组干扰组干扰组阴性对照组00.20.40.60.812阴性对照组干扰组48h72h1.00.80.60.40.2000.20.40.60.811.212系列1系列2RNA干扰的应用基因治疗方面抗肿瘤——应用RNAi技术抑制肿瘤细胞血管生长因子如血管生成素、angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，抑制肿瘤细胞癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达达到抗肿瘤生长及转移的目的抗器官移植排斥反应——细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断ICAM-1mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。抗病毒——斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎把dsRNA转入小鼠的肝细胞，被分解成siRNA后与小鼠体內的丙型肝炎病毒mRNA相结合，使之分解并失去转译蛋白质的功能。已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题：导入问题：使用高效载体传递siRNA；给药方式：因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性；高选择性：如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。第三节基因敲除技术GeneKnock-out•通过DNA同源重组•定向将外源基因插入宿主细胞染色体DNA中•从而使特定目的基因在细胞内或生物体内失活EmbryonicStemCells同源重组targettargetingvectorhomologousrecombination“knockout”TK5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´5´3´3´3´3´待剔除基因克隆克隆载体重组载体切割基因使待剔除基因失去活性阳性标记基因Neor连接HSV-tk打靶载体打靶载体内切酶消化线性化打靶载体转染基因组同源重组同源重组的胚胎干细胞胚泡植入假孕小鼠杂合子小鼠正常小鼠杂合子小鼠交配杂合子小鼠兄妹交配纯合子小鼠（基因剔除）