本科生《P》5-第五章目的基因制备与克隆策略3-10

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》《基因工程原理》Professor,Dr.DegangZhao(赵德刚)GuizhouKeyLaboratoryofAgriculturalBioengineering,CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversityE-mail:[e-mail]1第五章基因工程工具酶TheTooloftheGeneEngineering教学目的与要求：1）掌握II型限制性核酸内切酶的切割原理，和部分常用识别位点。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA连接酶和修饰酶在基因操作中的用途。2第一节目的基因的制备3目的基因（TargetGene）：指基因工程中需要进行制备、克隆或利用的基因。制备目的基因要根据需要获得DNA片段，可能是启动子、终止子、内含子，或者是编码某种蛋白完整的序列。目的基因制备方法有直接分离法、基因文库筛选法、PCR扩增法以及化学合成法等。一、目的基因的直接分离法1．限制性核酸内切酶酶切分离法这是最简单的获取目的基因的方法，主要是从质粒、病毒等比较简单的DNA分子或基因组中分离目的基因。无论是已知序列或是尚未测序的序列都可进行分离，只要确定目的基因两侧的酶切位点，就可用相应的酶进行切割，获得目的基因。42.基因分离的物理化学法其原理是根据基因的DNA分子两条链GC含量差异较大，理化性质、包括浮力密度和解链温度明显不同所采用相应的方法进行分离。（1）密度梯度离心法将DNA切割成适当片段，富含GC的双链DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速离心技术，可将DNA片段按不同密度大小分开。（2）单链酶解法基因GC含量高（三个氢键），Tm值高，热稳定性高，可通过控制解链温度使富含A=T区变性解链，GC区维持双链状态，再利用单链核酸酶S1酶切单链部分，获得富含GC的基因片段。（3）分子杂交法利用DNA单链易与互补链形成双链的原理，将已知基因DNA与目的生物的DNA进行复性，再用单链核酸酶S1酶切除单链，留下的双链即为目的基因序列53.双抗体免疫法分离编码蛋白基因基因翻译过程中，核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体。利用多肽链制备的抗体及二抗，与多聚核糖核蛋白体一起温育，目的基因的多聚核糖核蛋白体将通过抗原抗体反应与相应抗体形成复合物，利用不连续蔗糖梯度离心将此复合物分离出来，再通过酚/仿抽提法出去蛋白质部分，过oligo-dT柱层析，即可分离出特定蛋白编码的mRNA，反转录即可得到cDNA。目前，可用金黄色葡萄球菌中分离的proteinA代替二抗，再用proteinA-Sepharose4B作亲和层析，分离出特定的多聚核糖体（代替密度梯度离心）。64．利用酶促反转录直接从特定mRNA分离基因此法是在目的基因的mRNA占细胞中总mRNA量很大时采用，直接用逆转录酶合成cDNA，与载体重组后导入受体菌扩增，获得目的基因的cDNA克隆。如哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA占总mRNA的90%以上，用此法克隆了该基因。75．构建基因文库分离目的基因基因文库分基因组文库和cDNA文库。基因文库可用质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体（YAC）载体进行构建。从基因组文库可以分离获得基因编码序列、调控序列、启动子、终止子、核糖体识别mRNA序列、ARS、端粒序列、间隔序列等，可用于基因结构分析、基因表达和调控研究等。cDNA文库来自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表达的转录及加工后mRNA产物所携带的信息，所以从cDNA文库可以分离到基因的编码序列。8筛选基因文库的方法：①已知基因序列，可以人工合成核酸探针，通过核酸杂交，从基因文库中筛选出含目的基因的克隆。②已分离纯化某蛋白，并知其氨基酸序列，根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作为探针，筛选基因文库。③已纯化某蛋白，未能测出其氨基酸序列，可以该蛋白制备抗体，从cDNA表达文库中筛选出含该蛋白编码基因的克隆。④对编码产物未知的基因，采用特殊分离方法如差别显示技术、差减杂交法、遗传互补法等。9遗传互补法（功能互补法）原理：当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。营养缺陷型受体细胞+外源DNA→转化细胞涂布在合成培养基上→原养型细胞生长受体细胞（无某种表型）+外源DNA→转化细胞涂布在特殊培养基上→具有新性状细胞虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。实例：基因组文库DNA→转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因组文库DNA→转化E.coli（无纤维素酶活性）→转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈→纤维素酶基因10核酸杂交法（同源序列克隆法）：（1)原理利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因。（2)核酸探针种类①DNA探针:分离自某一种生物。②寡核苷酸探针:根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测，人工化学合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN对应mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探针序列Q：CT/UP：AG32种14聚体的混合物，其中必有一种与待测DNA完全互补。cDNA探针:利用特异性mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA混合物反转录而成。RNA探针:由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得。11分离步骤：基因文库→制备DNA样品膜→与标记探针杂交→杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子→作斑点和Southern杂交以确认杂交结果→DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。6．特异性DNA片段(基因)的PCR扩增124．目的基因的化学合成法（1）核酸片段化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亚磷酸三酯法，反应体系有液相和固相。目前常用的方法是固相亚磷酸三酯法。第一个核苷酸的3`端通过3`羟基与惰性固相载体上的间隔臂形成酯健，寡核苷酸按3`-5`方向进行化学合成，正常终产物是3`、5`端均带有羟基的寡聚核苷酸。合成原料：经化学修饰的核苷—亚磷酰胺。有两种类型：①甲基化亚磷酰胺；②ß-氰乙基-亚磷酰胺。合成时要对羟基、磷酸、氨基进行保护，合成结束后，去掉所有保护基团。固相载体：是对DNA合成试剂惰性的物质，目前采用可控孔径的玻璃沙（CPG）,其表面的硅氧烷键可与A、G、C、T核苷的3`-羟基以酯键连接，该键可用29%浓氨水打断。13反应分四步：1）二甲氧三苯甲基（DMT，羟基保护基团）的脱除用三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（DCA）处理，脱去连在固相载体上的核苷酸或寡核苷酸5`羟基的DMT保护基团。2）偶联反应（缩合反应，加成反应）由溶于无水乙腈中的四唑催化，使亚磷酰胺单体的3`磷酸基团与固相载体上的5`羟基发生反应，形成亚磷酸三酯键。3）封闭反应加成反应剩下的亚磷酰胺，以N-甲基眯唑催化，用乙酸酐使羟基乙酰化，封闭其羟基，防止在下一循环中发生加成反应。4）氧化反应在碱性条件下，以碘使加成反应形成的3`，5`亚磷酸三酯键氧化为稳定的5价磷酸三酯。上述每循环一次，增加一个核苷酸，需7~9min。每一步反应完成都以乙腈清洗，氩气吹干，保证无水环境。合成反应结束后，除去保护基团，29%浓氨水处理使寡聚核苷酸从载体上释放出来，乙醇或异丙醇沉淀、回收DNA。用RNA亚磷酸胺单体和聚苯乙烯固相载体，合成RNA。14（2）化学合成DNA片段种类①DNA互补链合成引物包括PCR引物和测序引物。②DNALinker预先设计，通过化学合成的寡聚核苷酸片段，含有1种或几种酶切位点，酶切可产生粘性末端。如果将含有多个酶切位点的Linker引入克隆载体中，就会形成多克隆位点（MCS），这种具有多克隆位点的连杆称MCSLinker。③Adaptor是一种化学合成的寡聚核苷酸，含有一种以上的内切酶位点。其与Linker的差别是Adaptor一端或两端已有1种或两种内切酶切割产生的粘性末端。④DNA芯片指DNA片段以事先设计的排列方式固定在载波片或尼龙膜上组成的密集分子排列。固定的是探针，或者是靶DNA分子。15（3）目的基因的化学合成法1979年，Khorana等首次化学合成基因有生物活性。有全片段酶促连接法和酶促填充法。165．利用表达序列克隆目的基因（1）表达序列标签法分离目的基因Expressedsequencetag，简称EST：指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为100~500bp。利用EST寻找新基因的策略即为表达序列标签法（ESTs）。最早由M.D.Adam在1991年建立并加以应用，有的文献称之为cDNA测序法。基本步骤如下：①从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行5‘端和3’端部分序列（约400bp）的测定。②通过对GenBank、EMBL或其他核苷酸序列数据库进行联机检索，可以检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列。将检测的序列与基因库中已知基因进行同源比较，可检测到已知基因和未知基因。③通过基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。表达序列标签法分离目的基因有时可以从几个不同基因的高度保守区得到相同的cDNA片断，有时一个较大的基因不同外显子又能表现为若干不同的cDNA。17（2）计算机克隆(siliconcloning)或生物信息学(bioinformatics)克隆新基因策略生物信息学克隆新基因策略是表达序列标签法的延伸和发展。生物信息学与计算机科学、信息学等学科相互交叉而诞生的一门新兴学科，核心内容是通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。做法：利用已发现的其他物种基因的cDNA序列为参照，在国际互联网的EST数据库（GebBank或EMBL等）中进行同源搜索，获得一系列同源的或部分重叠的EST序列，然后用GCG、DNAstar软件中的alignment程序将它们拼接成一个EST重叠群(contig)，经过逐步延伸（cDNAsalking)及整合后可获得全长的cDNA序列；根据该推测的序列，可合成相应的特异引物，进行PCR扩增后，即可获得该基因的cDNA片断。局限性：难以寻找到一些表达量极低或者不表达的新基因类型，克隆基因的功能也有待鉴定。18（3）基因表达系列分析法基因表达系列分析法(serialanalysisofgeneexpression,简称SAGE)可一次对大量基因转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。原理（两个）：①从转录物某一特定位置上分离得到一段9~10bp的寡核苷酸序列标签(sequencetag,ST)，它含有确定的一个独特转录物的足够信息量，可代表此转录物的特异性。理论上随机排列的9bp片断可区分262144（49）种转录物，人类的基因约仅有80000个转录子，因此，9个核苷酸序列可以代表所有转录子的特征。②多个序列标签（ST）能以锚定酶(anchoringenzyme,AE，识别位点为4碱基的限制性核酸内切酶)识别位点序列相隔相互连成双标签序列(ditag)的多联体，将该多联体序列克隆到一个载体中，用连续的方法进行多联体序列分析，再通过计算机处理，确定每一种序列（ST）代表转录产物的种类和出现频率，由此实现对转录物的高效、快速和大量的分析。196．筛选目的基因片断的差别杂交及减法杂交技术（1）差别杂交法差别杂交（differentialhybridization）或称为差别筛选(differentialscreening)法