毛细管电泳原理及分析策略

毛细管电泳分离原理及分析策略贝克曼高效毛细管电泳仪•毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)。毛细管电泳的原理1装置毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液高压电源（可高至30KV）2电泳和电渗–电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。–电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。2电泳和电渗–电泳行为与特性使用淌度描述即单位场强(E)下离子的平均电泳速度υμep=υ/E实验中，只发生电泳时有效淌度μef=υef﹒(L/V)=(l/tm)﹒(L/V)毛细管有效长度迁移时间毛细管总长度电压2电泳和电渗–电渗与固液界面的双电层有着密切的关系在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmoticflow,EOF）。固液两相间的总电势-热力学电势-φ0Zeta电势-ζ2电泳和电渗–电渗流的流型特点电渗流HPLC塞流层流2电泳和电渗–电渗流的表示电渗流的大小可用淌度(μeo)或电渗流系数表示μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)电渗流速度毛细管有效长度电渗流流出时间电场强度第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理2电泳和电渗–电渗流的意义1.电泳过程中，伴随着电渗现象2.电渗流的速度比电泳速度快5－7倍3.利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。分情况而论2电泳和电渗–改变电渗流的方法1.改变外加径向电场2.改变缓冲液成分和浓度Zeta电势3.改变缓冲液pH4.加入添加剂5.改变温度粘度盐-离子强度表面活性剂µeo正比于Zeta电势和介质的介电常数反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度反比于介质的介电常数表观电泳淌度µapμap=υap/Eυap为离子的表观迁移速度υap=υef+υeoµap=µef+µeo2电泳和电渗3分离效率和分离度–分离效率柱效可以用理论塔板数n表示n=(µep+µeo)Vl/(2DL)毛细管电泳分离的柱效方程理论塔板高H=L/nn=5.54(χ/W½)2实验上可按上式求出理论塔板数χ为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离W½为电泳峰的半高峰宽3分离效率和分离度–分离度电泳中两峰的分离度（Rs），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为Rs=（n1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相邻两区带的迁移速度差υ平为两者的平均速度Δυ/υ平表示分离选择性n为柱效–分离度计算式Rs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)tm1、tm2分别为两个组份的迁移时间W为峰底的宽度3分离效率和分离度4区带宽度及其展宽因素–区带宽度展宽因素1.焦耳热2.进样3.电泳扩散4.毛细管壁对组分的吸附–焦耳热细内径（100µm），粗外径的毛细管柱温度轮廓----黏度轮廓----速度轮廓4区带宽度及其展宽因素–进样试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。一般进样区带控制在柱长的1%–电泳扩散试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。µs---µb峰前展或拖尾？4区带宽度及其展宽因素–毛细管壁对组分的吸附电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用极端pH条件●加入中性盐或两性离子化合物●对毛细管内壁进行涂层处理需要注意：方法也会抑制或改变电渗流4区带宽度及其展宽因素CE分离原理-与模式有关•毛细管区带电泳（CZE）•毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）•毛细管凝胶电泳（CGE）•毛细管等电聚焦（cIEF）•亲和毛细管电泳（ACE）•毛细管电色谱（CEC）第一章毛细管区带电泳样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快进样方式压力进样电动进样浓缩进样毛细管种类•非涂层毛细管（裸管）•内壁涂层毛细管（涂层管）非涂层毛细管-电渗流的概念-H+高pH低pH电渗流的特点EOF-+纯电泳状态-+EOF电泳+电渗流0tm(min)电渗流的作用电渗流的活塞流特点•Hydrodynamicflow–Parabolic–Resistancetoflowatsurface–Morediffusion/broaderdetectionzone•EOFgivesplugflow–Minimizesbandbroadening–Narrowsdetectionzone•Hydrodynamicflow–Parabolic–Resistancetoflowatsurface–Morediffusion/broaderdetectionzone•EOFgivesplugflow–Minimizesbandbroadening–Narrowsdetectionzone电渗流的活塞流特点电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用•正面作用•增加分离速度•使得正、负电荷物质同时分离•负面作用•减少分离时间和分离有效距离•电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性影响电渗流的因素•pH值pH越高，电渗流越大•离子强度离子强度越高，电渗流越小•缓冲溶液添加剂离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随pH的变化情况控制电渗流的三个重要手段1.采用涂层毛细管，消除电渗流的影响2.改变pH，从而调整电渗流的大小。pH3时电渗流很低；当pH10以后，电渗流基本不增加3.添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用缓冲溶液的影响和选择•在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：1.在所选的pH范围内有较强缓冲能力；2.在检测波长处有低的紫外吸收；3.小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris,borate,CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的CE缓冲体系•磷酸钠体系宽缓冲范围•硼酸钠体系高pH范围•Tris-HCl体系低pH范围•醋酸-醋酸铵体系CE/MS常用体系CZE分离条件的选择•毛细管类型--涂层还是非涂层？•毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？•缓冲液体系--种类和pH值•添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈•检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光缓冲溶液的选择可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。缓冲溶液及pH值的选择研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。缓冲溶液及pH值的选择pH的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。缓冲溶液及pH值的选择在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。缓冲溶液及pH值的选择缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。添加剂的选择•目的：1.改善分离2.抑制分析物在毛细管上的吸附添加剂的选择1.甲醇|乙腈（5-50%）•降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果•增加非极性物质的水溶性2.环糊精|SDS等表面活性剂•增加分离选择性，提高分析效果•降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果3.非极性高分子聚合物•掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附•降低电渗流•形成一定的分子筛，提高分子大小选择性第二章毛细管胶束电动色谱电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。毛细管胶束电动色谱原理SDS-+EOFMicellarElectrokineticChromatography(MEKC)七种青霉素的分离(A)CZE:20mMPi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.胶束电动色谱的特点•优点•增加对弱极性物质分离的分离度•在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用•缺点•稳定性不佳，达到好的重复性比较困难第三章毛细管凝胶电泳毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。•主要用于核酸片断及蛋白分子量分析毛细管凝胶电泳CE双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控1.02.03.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS2110.015.0RelativeFluorescenceIntensitydsDNA片段(72bp-12Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析第四章毛细管等电聚焦第五章亲和毛细管电泳-分离条件基于CZE当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。•用于研究1.分子间相互作用测定，分子构型变化2.特定物质检测3.活性物质筛选ACE测定分子间结合常数与解离速率JAK2与SH2-B之间的相互作用研究CE药物筛选ACE用于相互作用筛选•适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力•目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的1.IgE2.HIVtype1reversetranscriptase3.Thrombin4.Anti-thrombinIII5.TaqDNApolymeraseACE用于相互作用筛选•传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周•而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度--MicroScaleBioseparations2006第六章检测器选择•小分子检测•大分子检测CE检测器种类及性能••检检测测系系统统HHPPCCEE的的种种类类及及性性能能检测方式质量检测限(mol)浓度检测限(M)*优缺点紫外-可见光吸收10-13～10-1610-5～10-8接近通用型，DAD可给出光谱信息荧光10-