2013两水相系统中蛋白质分配系数的测定

上课前：每组清洗一个50ml容量瓶用蒸馏水润洗后备用不用烘干两水相系统中蛋白质分配系数的测定指导教师：龚小雁张秀萍了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法。一、实验目的和要求本实验中：二、实验原理两水相系统：PEG/(NH4)2SO4分配对象：糖化酶蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝比色法两水相分配：在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。分配系数K：当萃取达到平衡时，蛋白质在上下两相中的浓度之比，对于固定的相系统，K为常数。K=C上/C下相比R：上下相体积比。R=V上/V下二、实验原理二、实验原理糖化酶：生物大分子蛋白，α-１,４-葡萄糖水解酶。黑曲霉经发酵制得。广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，将淀粉转化为葡萄糖。考马斯亮蓝比色法：常用的蛋白含量检测方法。考马斯亮兰G-250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质结合后转为蓝色，595nm波长下有最大吸收值。低浓度范围内（0.01～1.0mg/ml），与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。二、实验原理试剂：PEG400、蒸馏水、(NH4)2SO4、糖化酶、考马斯亮蓝、牛血清蛋白等。器材：移液管、刻度离心管+盖子、台秤、离心机、试管、50ml容量瓶、恒温水浴锅、分光光度计+比色皿等。三、实验器材与试剂（一）试剂配制（已配好）1.考马斯亮蓝G-250溶液：精确称取50mg考马斯亮蓝，溶于10ml95%乙醇中，并加入50ml85%浓磷酸，用H2O稀释定容至500ml。2.牛血清蛋白溶液（BSA）：精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成120g/ml的牛血清蛋白原液。四、操作方法（二）蛋白质在两相中的分配10ml刻度离心试管(NH4)2SO4固体1.30克PEG4002.00克糖化酶2.00ml水台秤总重8.00g振摇混和(固体充分溶解)离心3000转/分5min求相比：R=V上/V下求分配系数：K=C上/C下四、操作方法平衡（三）考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量1.制作标准曲线：在试管中，按下表精确加样，反应检测。2.两相中取样及蛋白测定：上相液：吸取0.5ml，蒸馏水定容至50ml，取1ml稀释液于试管中，按下表反应检测。下相液：吸取0.1ml于试管中，加入0.9ml水，按下表反应检测。标准曲线样品检测BSA/ml00.20.40.60.81.0上相稀释液1.0ml下相稀释液1.0mlH2O/ml1.00.80.60.40.20加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却OD/595nm蛋白量g空白对照绘制标准曲线：标准曲线方程（线性回归）：蛋白量：y=ax+b上相：C上=(ax1+b)*100ug/ml下相：C下=(ax2+b)*10ug/ml分配系数的计算：OD蛋白含量/μg分配系数K=C上/C下操作注意点蛋白质分配：1.称重时，按顺序加入物料，中间不要再去皮，最终控制累积总重8.00g。2.橡皮塞不干净，用保鲜膜包裹下。3.离心前试管必须要两两称重平衡。取样：3.不要取相界面附近的样品。4.取下相样品液时，先用滴管将上相完全吸掉，并吸掉部分下相后，再取样。5.避免将上相混入下相。检测：6.试管中加完物料后，要混和均匀。7.保温结束后，立即放入冷水中，待测。3.分光光度计空白参比管T模式调100%，A模式调0。（一）预习1.配制两水相萃取系统时，PEG400液体的加量能否改为量取相应的体积？说明理由。2.试述使用台式离心机的操作顺序。3.用比色法分析上下相蛋白质浓度时，如何精确吸出在同一离心试管中的上下两相？写出操作步骤。（二）实验结果和讨论1.将比色分析的操作过程及结果列成表格，作出标准曲线，线性回归。2.计算上下相蛋白质浓度、分配系数K、相比R，计算两相中PEG和(NH4)2SO4的含量。3.在配制两水相系统时，为什么必须充分混合？混合不充分会带来什么影响？五、思考题M：系统组成T：平衡时上相组成B：平衡时下相组成TMB：系线同一条系线上各点系统组成不同，但平衡后分成的两相组成相同，体积比不同，上下相体积比：VT/VB=BM/MT=RQ/%P/%值日生第九组第十组第十一组第十二组擦干净实验桌面整理好试剂药品扫地、拖地