MDMA神经毒性长期效应导致皮层和海马组织结构改变

生理学报ActaPhysiologicaSinica,February25,2006,58(1):34-40*Correspondingauthor.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]神经毒性长期效应导致皮层和海马组织结构改变李素霞1,2,李静1,王雪1,彭组贵1,况伟宏1,黄明生1,*四川大学1基础与法医学院；2华西医院心理卫生中心，成都610041摘要：通过短时间多次给药建立3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(3,4-methylenedioxymethamphetamine,MDMA)的神经毒性模型，将雄性Wistar大鼠随机分为对照组和实验组，实验组给予MDMA10mg/kg，每小时一次，共4次，即总量为40mg/kg，对照组给予等体积生理盐水。于末次给药后32周采用原位杂交检测5-HT转运体(serotonintransporter,SERT)mRNA和内源性焦虑物质苯甲二氮结合性抑制物(diazepambindinginhibitor,DBI)的mRNA表达，免疫组织化学染色检测胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表达，银染观察神经末梢变化。结果显示，短时间多次给予MDMA后，与生理盐水组比较，MDMA组大鼠海马SERTmRNA信号表达降低(P0.05)，大脑皮层DBImRNA的信号表达增高(P0.05)，GFAP表达显著升高(P0.05);银染MDMA组大鼠皮层神经末梢明显减少。上述结果提示，MDMA神经毒性导致皮层和海马结构改变持续存在，进而导致脑功能的紊乱。关键词：MDMA；神经毒性；内源性焦虑物质；5-HT转运体；胶质纤维酸性蛋白；神经末梢中图分类号：Q427;R338.62Long-termneurotoxiceffectsofMDMAresultincorticalandhippocampalstructuralchangesLISu-Xia1,2,LIJing1,WANGXue1,PENGZu-Gui1,KUANGWei-Hong1,HUANGMing-Sheng1,*1BasicandForensicSchool;2CentralofPsychologyHealthofWestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,ChinaAbstract:3,4-Methylenedioxymethamphetamine(MDMA)isasubstitutedamphetaminewithstimulatingandhallucinogenicproperties.SinceMDMAinduces“ecstasy”,itisextensivelyusedasa“recreational”drug.IthasbeenwellestablishedthatMDMAisneurotoxicandcanresultinlong-termdegenerationofcerebral5-hydroxytryptamine(5-HT)nerveterminalsinmanyspecies.Thepresentstudywasundertakentoinvestigatethelong-termneurotoxiceffectsofMDMAoncorticalandhippocampalstructures,byrepeatedlyadministeringMDMAinshorttime.MaleWistarratswererandomlyassignedtocontrolgroupandMDMA-treatedgroup.MDMA(10mg/kg)wasadministeredtoratsofMDMA-treatedgroup,onceperhour,total40mg/kg;ratsofcontrolgroupweretreatedwiththesamevolumeofsaline.Thirty-twoweeksafteradministeringMDMA，theexpressionofserotonintransporter(SERT)mRNAanddiazepambindinginhibitor(DBI)mRNAwasdetectedbyinsituhybridization.Theexpressionofglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)wasdetectedbyimmunohistochemistry,andthedegenerationofnerveterminalswasdemonstratedbyBielschowskyandGleeMarslandsilverstaining.TheresultsshowedthattheexpressionofSERTmRNAinhippocampusdecreasedby31.96%,whileexpressionofDBImRNAinneocortexincreasedby40.51%,comparedwiththecontrolgroup(P0.05).TheexpressionofGFAPinthebraintissueincreased(P0.05),whilesignificantreductionofthenerveterminalsinneocortexwasdemonstratedbysilverstaining,comparedwiththecontrolgroup.TheseresultssuggestthattheneurotoxicityofMDMAresultsinsustainedcorticalandhippocampalstructuralchanges,whichinturnresultindisorderofthebrainfunctions.Keywords:3,4-methylenedioxymethamphetamine;neurotoxicity;diazepambindinginhibitor;serotonintransporter;glialfibrillaryacidicprotein;nerveterminal3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(3,4-methylene-dioxymethamphetamine,MDMA)属于苯丙胺类中枢兴奋剂(amphetamine-typestimulants,ATS)。一次性给大鼠注射MDMA，会引起脑内5-羟色胺(5-HT)和它35李素霞等:MDMA神经毒性长期效应导致皮层和海马组织结构改变的代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的双相减少以及5-HT合成限速酶色胺酸羟化酶活性的降低。MDMA(20mg/kg)在给药后3~6h内引起5-HT急性耗竭，此后，5-HT在24h内恢复至对照水平。MDMA的神经毒性作用在给药后的24h至1周之间表现出来。到第7天，这种5-HT浓度的第二次下降与功能性的5-HT回收位点的丧失有关，5-HT回收位点的丧失标志着5-HT能神经末梢损害[1]。大剂量一次给药(20mg/kg或更大剂量)或多次中等剂量给药,典型的给药方法是5mg/kg，一日两次，连续4d，都可获得MDMA的长期神经毒性作用[2-5]。MDMA的长期神经毒性作用表现为选择性对5-HT能神经末梢产生毒性。长期慢性使用、短时间反复使用或一次性大剂量使用均可导致长期神经毒性。主要表现为中枢神经系统5-HT能神经末梢变性后的后遗精神行为异常：患者主要表现为惊恐发作、焦虑、失眠、抑郁、自杀、持续性偏执精神病、急性精神病、记忆障碍等[6]。大剂量使用MDMA与睡眠障碍、抑郁情绪、持续性的严重焦虑、冲动性和敌意、选择性的事件记忆、工作记忆、注意力损害有关。实验证据表明这些认知功能损害在停止使用MDMA后至少持续6个月[7]，而严重焦虑和敌意要在停止使用MDMA后约1年时间才能改善[7]。这些现象都提示大脑组织结构可能发生了改变，进而引起脑功能的长时间异常。有关这方面的研究国际上报道尚少，国内尚未见报道。本研究将采用短时间反复给药方法，持续观察32周，从相关基因、蛋白、神经末梢水平，就MDMA神经毒性长期效应对中枢神经系统组织结构影响作一研究。1材料与方法1.1材料1.1.1动物　　Wistar雄性大鼠16只，体重(209±28.47)g，购自四川大学实验动物中心，将动物随机分2组，一组10只为实验组，另一组6只为对照组。实验条件：用药后的24h保持环境温度达28℃，24h后逐渐恢复至(22±2)℃，并持续13周，以保证MDMA神经毒性的充分表现。12h明-12h暗交替照明，自由进食进水。1.1.2药品和试剂　　MDMA由中国药品生物制品检定所提供，用生理盐水溶解，浓度为10mg/ml，给药体积为1ml/kg。0.9%生理盐水和10%水合氯醛由四川大学华西医院药房提供。5-HT转运体(serotonintransporter,SERT)mRNA和苯甲二氮结合性抑制物(diazepambindinginhibitor,DBI)mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司；胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)(兔单克隆抗体，稀释为1∶200)购自北京中山公司；其它试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1动物实验过程　　实验组腹腔注射MDMA10mg/kg，每小时一次，连续4次，总量40mg/kg，对照组注射等体积生理盐水。1.2.2取材过程　　上述各组动物在第32周经10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，剥离脑组织，经矢状位切开，随机取一侧半球，迅速置于冰冻切片机中，行4µm的连续矢状切片，取其中包含海马、纹状体及皮层等脑结构的切片4张，置于-20℃冰箱中备用。剩余脑组织置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，制成厚度为4µm的连续矢状切片4张备用。1.2.3SERTmRNA原位杂交检测　　设计的探针为针对SERT的寡核苷酸探针，经地高辛标记。试剂盒内容：胃蛋白酶(×10；pepsin)2ml；预杂交液2ml；SERT寡核苷酸探针杂交液2ml；封闭液5ml；生物素化鼠抗地高辛5ml；SABC-POD5ml；生物素化过氧化物酶5ml。SERT靶基因的mRNA序列为：(1)5'-GGCGCTTCCCCTACATATGTTCCCAGAATG-3'(2)5'-AGGTGGTGTGGGTGACAGCCACCTTCCCTT-3'(3)5'-TGGTTCTGGAGGATCTGCTGGGTGGCCATC-3'操作程序严格按试剂盒说明书提供的方法进行。1.2.4DBImRNA原位杂交检测　　设计的探针为针对DBI(GABAreceptormodulator,acyl-coenzymeAbindingprotein)的寡核苷酸探针，经地高辛标记。试剂盒内容：胃蛋白酶(×10；pepsin)2ml；预杂交液2ml；DBI寡核苷酸探针杂交液2ml；封闭液5ml；生物素化鼠抗地高辛5ml；SABC-POD5ml；生物素化过氧化物酶5ml。DBI靶基因的mRNA序列为：(1)5'-AGCTGAAAGGAACTTCCAAGGAAAATGCCA-3'生理学报ActaPhysiologicaSinica,February25,2006,58(1):34-4036(2)5'-GTAGAAGAGCTAAAGAAGAAATATGGAATA-3'余同SERTmRNA。1.2.5GFAP免疫组织化学染色　　严格按试剂盒说明书进行。1.2.6Bielschowsky及GleeMarsland氏改良银浸染法[8]　　观察神经末梢的