实验12小麦成熟胚愈伤组织诱导

实验十二小麦成熟胚愈伤组织诱导•实验目的•实验原理•实验材料与药品•实验方法•注意事项•实验作业实验目的•掌握无菌操作技术，了解组织培养的一般程序，将小麦成熟胚培养成愈伤组织。植物组织培养指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。实验原理植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。•外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的那部分材料。•愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则薄壁细胞，多在植物体切面上产生。•脱分化：已分化好的组织细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。或者说是由高度分化的植物组织或器官产生愈伤组织的过程。•再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。或者说是由愈伤组织再生出小植株的过程。•植物体的任何一个细胞都具有全能性。分化了的植物根、茎、叶等组织器官在一定的条件下进行离体培养，给于一定的营养和激素，可以脱分化为愈伤组织。愈伤组织在不同的营养和激素的作用下，又可以再生出完整的小植株。植物的脱分化和再分化培养，证明分化了的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的全套基因。应用领域快速繁殖一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到500万株左右。种苗脱毒通过组织培养可以培育出大量的无毒种苗。已取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。远缘杂交利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。突变育种组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。中国林科院获得了耐盐的杨树株系。基因工程基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。生物制品如抗癌首选药物-紫杉醇等。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量很高的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。愈伤组织利用外植体能培养出完整植株从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。完全在于高等植物细胞具有全能性蝴蝶兰蝴蝶兰虎头兰红豆杉植物组织培养特点①培养条件可以人为控制摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。②生长周期短，繁殖率高往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。培养基培养基：是植物组织培养的重要基质。没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。培养基的种类：MS,B5,N6,White,KM-8P等。MS培养基的组成无机营养：大量元素：N、P、K、S、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、Cu、Co、Mu、B等有机营养：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖氮源：氨基酸类活性物质：维生素、肌醇等植物激素：生长素类：2,4-D、IAA、NAA、IBA等细胞分裂素类：6-BA、激动素、玉米素等其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯支持物：琼脂等激素配比模式•生长素与细胞分裂素的比例决定着外植体的发育方向，是形成愈伤组织、长根还是长芽。大量实验结果表明，大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论，即当生长素与细胞分裂素的比例高时，愈伤组织仅形成根；生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗；而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。培养基母液配制•为了使用方便和用量准确，常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度大若干倍的母液。当配制培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液稀释即可。•母液应保存在冰箱中备用，保存时间不可过长，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能使用。培养基的制备——母液的配制和保存(1)大量元素母液可配成浓度10倍母液。(2)微量元素母液可配成浓度100倍的母液。(3)铁盐母液可配成100倍的母液，(4)有机物母液可配成100倍的母液。(5)激素母液的配制每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成0.2mg／ml。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。MS培养基母液的配制配制母液时的注意事项•1).各化合物必须充分溶解后才能混合。•2).混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。•3).混合时要慢，边搅拌边混合。培养基的配制、消毒与分装100倍微量元素母液(10ml)10倍大量元素母液(100ml)调pH到5.8100倍铁盐母液(10ml)培养基100倍有机物质母液(10ml)定容到1000ml2,4-D2mg/L6-BA0.5mg/L琼脂粉６g溶解分装（每瓶30ml)高压灭菌蔗糖３０g实验材料与药品•小麦籽粒•MS培养基+2mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA•70%酒精•2.5%NaCLO•无菌水实验方法•培养基的配制。•小麦籽粒用无菌水浸泡10小时。•取材、消毒和接种。正式接种前30min，打开超净工作台上的紫外灯和风机，30min后接种；上超净台的第一件事是关闭紫外灯并打开照明灯；把解剖刀、镊子、解剖针等器械浸泡在75％酒精中；点燃酒精灯；用75％的酒精棉球擦拭双手；外植体的消毒：把麦粒置于70%乙醇中浸泡5min，之后在2.5%NaClO中消毒15min，然后用无菌水冲洗3次。•超净台上操作（１）用酒精棉球擦手，然后点燃废酒精棉球擦拭超净台工作台面。取出一张无菌滤纸，放在面前。（２）用酒精灯火焰烧灼刀柄、刀片、镊子等，自然冷却后置于无菌滤纸上。（３）取一瓶培养基，除去橡皮筋，揭开封口膜，把培养基放在紧靠酒精灯火焰无菌区的后方。（４）用酒精棉球擦手，尤其是左手拿麦粒的二个手指和指甲边缘。（５）剥离成熟胚并接种，盾片一面向上。注意无菌操作，均匀接种10个即可。（６）盖好封口膜，缠好皮筋，用记号笔在培养瓶封口膜上写好班级姓名。•放入培养箱，25℃培养7-10天后观察记录。小麦种子培养基消毒、外植体消毒、超净台消毒和操作者无菌操作是否符合规范，是防止菌类污染的关键；每剥离接种完一个胚，接种工具均要在点燃的酒精灯上进行烧灼消毒。每一步操作都不要远离酒精灯火焰无菌区。注意防火（盛有酒精用于浸泡接种工具的器皿要远离酒精灯）。接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意事项实验作业•每人接种10个成熟胚，培养7-10天后观察，并计算出愈率和出芽率及污染率。愈伤组织再分化出苗