microRNA解读-PPT课件

microRNAmicroRNA的出现1993年，Ambros首先在Cell杂志上撰文发现了一段非编码的单链小分子RNA，具有调解发育时相的作用，这是对microRNA的首次报道。近年来，Cell/Nature/Science连续把RNA的研究进展列为“十大科技突破之一”，其中最引人注目的是microRNA。什么是microRNA?MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。关于microRNA的一些研究最近的研究表明大约70%的哺乳动物miRNA基因是位于TUs区(transcriptionunits,TUs)(Rodriguezetal,2004),且其中大部分是位于内含子区(Kim&Nam,2006)。一些内含子miRNA基因的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinellietal,2000;Ruvkunetal,2001;Lee&Ambros,2001)。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系,研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。什么是同源性？进化过程中源于同一祖先的分支之间的关系。由于进化上或个体发育上的共同来源而呈现的本质上的相似性，但其功能不一定相同，如狗的前肢和鸟的翅。从分子水平讲则是指两个核酸分子的核苷酸序列或两个蛋白质分子的氨基酸序列间的相似程度。虽然同源性须通过序列测定来检验，但是DNA-DNA或DNA-RNA杂交可提供有价值的估计。microRNA的存在形式MicroRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt（nt=核苷酸nucleotide）的成熟miRNA。Dicer酶是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。microRNA的特征已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构，约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。什么叫发夹结构？发夹结构（hairpinstructure）：RNA是单链线形分子，只有局部区域为双链结构。这些结构是由于RNA单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成的，称为发夹结构。microRNA的功能对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育（Reinhart2000），细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡（Brennecke2003），脂肪代谢（Xu2003）和细胞分化（Kawasaki2003）。此外，一个研究表明，2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关，提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系（Calin2002）。然而，大多数的miRNAs的功能仍然是个迷。microRNA的作用方式最早发现的两个miRNAs——lin-4andlet-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译。多个果蝇miRNAs也被发现和他们的目标靶mRNAs的3‘非编码区有部分同源。由于miRNAs和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点变得困难。因而也无法确定miRNAs的作用方式是什么，以何种机制影响mRNA的翻译，以何种方式调控基因表达。miRNAs的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。研究microRNA的新工具小分子RNA的分离：现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA。miRNAIsolationKit主要采用玻璃纤维滤膜离心柱（glassfiberfilter，GFF）方法分离。小分子RNA探针的制备：要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’s端另外增加8个和T7启动子互补的碱基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7RNA聚合酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。研究microRNA的新工具小分子RNA的检测;由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具，由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难。目前多数采用NorthernBlots——一种技术复杂而费力的方法。改进新方法：将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通过变性胶电泳放射自显影检测结果。