第一章植物组织培养实验室构建

第一章植物组织培养实验室构建主讲生物科学与技术学院薛春丽联系电话：3746885Email:[e-mail]教学目标：（1）理解组织培养实验室的设计原则；（2）掌握组织培养基本布局以及相应仪器设备；（3）了解组培苗生产规模与实验室组建经费预算；（3）能够根据需要和实际情况科学设计组织培养实验室。重点：组织培养实验室设计与经费预算难点：组织培养实验室的设计一、组培实验室设计原则：１、防止污染、控制污染、保证无菌操作。２、按照工艺流程科学设计，达到经济、实用和高效。３、结构布局合理，工作方便，节能、安全。４、规划设计与工作目的、规模及当地条件等相适应。第一节实验室设计二、组培实验室基本组成洗涤室药品室称量室培养基制备室灭菌室无菌培养基储放室无菌操作室（区）培养室（区）细胞学观察室驯化移栽温室▼可以根据实际条件进行合并化学实验室（准备室）（1）地理位置要求：地形开阔，地势高燥，交通运输、水电方便。环境清洁，空气清新，周围50米以内要没有酱醋作坊、牧场、畜禽圈舍及饲料库和“三废”排放的工厂。（2）接种室要求：为减少杂菌污染接种室房间不宜过大，尽量密闭，并设有缓冲间，再进入接种操作间。（3）培养室要求：最好建设在房屋南面，保温、通风且光线充足的房室，培养室墙面应尽量设有大窗户，以便能最大限度采用自然光，节药能源。三、组培实验室的设计1、实验室选址要求根据组培生产流程合理设置，使其形成一条流水作业的生产线，以提高工效和保证组培苗生长的无菌环境，组培实验室应按照：配制培养基→蒸汽灭菌→分离或接种→无菌培养的流程进行平面布局，以提高工效和保证组培苗生长的无菌环境。2、组培实验室的布局组培实验室布局图示仓库准备室灭菌室接种室培养室办公室温室大棚门口仓库准备室灭菌室接种室培养室办公室温室大棚入口红河学院植物组织培养实验室平面图一、准备室1、功能：完成培养基配制所使用的各种药品的贮备、称量、用品洗涤、培养基配制与分装等工作。2、主要设备用具：药品柜、冰箱、电子天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。3、设计要求：面积一般为25-50m2,要求宽敞、明亮、通风、干燥、便于多人同时操作，配水源和排水设施。有条件时可将洗涤室、药品室和培养基配制室分开。第二节实验室的功能及要求二、灭菌室1、功能：用于培养基、器皿、工具及其它物品的消毒灭菌。2、仪器及用具配置：高压灭菌锅、高压灭菌器、干热灭菌箱、细菌过滤器等3、设计要求：面积一般为10-25m2,要求通风、防潮、配水源和排水设施，电源要求较安全，设漏电保护装置。生产规范较小时，灭菌室可与洗涤室、药品室和培养基配制室合在准备室。三、无菌操作室（接种室）：1、功能：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。2、主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。3、设计要求：接种室宜小不宜大，一般10～50平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。接种室应设有缓冲间，面积２－5m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。接种室和缓冲间要求在适当位置安装紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。1、功能：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其大小可根据生产规模而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。周围墙壁最好有绝热防火的性能。2、主要设备：光照培养箱、生态培养箱、振荡培养箱、恒温培养箱、培养架、紫外光源等。四、培养室：3、设计要求：（1）培养室的大小可根据生产规模和培养架的大小、数目及其他附属设备而定。（2）能够控制光照和温度。（3）保持清洁，远离污染源，防止微生物污染。（4）能够通风、降湿、散热。（5）培养室应设有缓冲间或走廊。1、功能：该室用于对组培苗的炼苗与移栽。2、主要设备：苗床、喷雾系统、加湿机、二氧化碳机、配比施肥机等。3、设计要求：面积视生产规模而定，要求环境清洁无菌，具备控温、控湿、遮荫、防虫和采光良好等条件。（五）大棚或温室第三节、组培基本仪器和设备一、玻璃器皿1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、果酱瓶等。2、分注器：漏斗、移液管、量筒等。3、其它玻璃器皿：烧杯、容量瓶、试剂瓶等。培养瓶移液枪1、镊子2、解剖刀3、剪刀4、接种针5、电热灭菌器6、电炉7、推车等8、锅具等接种器具灭菌器电炉推车二、金属器械三、基本仪器与设备１、灭菌设备：（1）包括：卧式灭菌锅、立式灭菌锅、手提式灭菌锅、高压锅等。主要用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌。（2）工作原理：利用高压灭菌锅产生的高压湿热水蒸汽（温度121-126℃、压力0.11-0.15MPa），来达到杀灭细菌和真菌的目的。手提式高压灭菌锅的结构２、接种设备：（1）包括：超净工作台、无菌接种箱等，主要用于培养材料的消毒及接种。（2）工作原理（超净工作台）：风机将空气通过微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超极滤清器”后吹送出来，除去大于0.3微米的尘埃、真菌（3－10微米）和细菌孢子（0.4－1.0微米）等，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，在超净台面制造无菌区。单人单面超净台双人单面超净台单人双面超净台老式接种箱（1）包括：恒湿箱、光照培养箱、植物生长箱、生态培养箱、振荡培养箱、光照培养架等,主要用于接种后材料的培养。3.培养设备：培养架一般设4-5层，最低一层离地高约10cm，其他每层间隔30cm左右，培养架高1.7m左右（或根据培养室层高而定）。其宽度一般为60cm，长度根据日光灯长度而设计，每架培养架可放置培养瓶数为：17*7*2*5=1190瓶/架。电源开关分组控制，可根据培养需要调节开灯数量以控制光照强度，可更换不同光质灯管，以满足对不同光质的要求。光照培养架的设计：包括分析天平，电子天平，药物天平等，用于制备母液时培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类物质，天平的精确度要到0.0001g，这就要求精确度更高的分析天平。4、称量设备：（1）冰箱：用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，以及某些材料的预处理。5、其它辅助设备（2）空调：用于接种室和培养室温度的控制。（3）消毒机：臭氧机、等离子发生器：（4）除湿机用于干燥洗净后的玻璃器皿，还可用80℃的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。器皿包装→160℃~170℃2h干燥箱使用注意70℃以下开箱取物，勿超180℃随用随开包（5）干燥箱（6）纯水机与蒸馏水发生器：（7）酸度计：用于校正培养基和酶制剂的PH。（8）光学显微镜、解剖镜等。用于茎尖的分离及不同时期培养物的观察及图像资料的收集。第四节培养条件的调控一、温度：２５±２℃二、光照：１、光照强度：1000-5000LＸ２、光照时间：8-12h３、光质：（1）蓝光促进苗的生长和分化（2）红光促进根的分化（3）暗培养使培养物停留在芽的分化三、湿度（１）培养瓶内湿度100%（２）室内湿度30-40%四、气体：氧气、二氧化碳、乙烯（不利）五、渗透压：培养材料渗透压等渗或略低于培养基渗透压六、PH值：5.6-6.5第五节实验室组建经费预算一、组培苗生产计划与生产规模1、生产计划的制定：销售量=实际生产量×[1-损耗率（5-10%）×移栽成活率（90-95%）2、实际生产量（Y）决定于无菌母株苗数（m）、每周期增殖倍数（X）和年增殖周期数（n），其公式为：Y=mXn二、生产规模1、存瓶增殖总瓶数=月计划生产苗数/每个增殖瓶月可产苗数2、月计划生产苗数=每个操作人员每天可接苗数×月工作日×人员数三、年产100万苗组培实验室的规划设计销售量=实际生产量×[1-损耗率（5-10%）×移栽成活率（90-95%）如果年产100万苗，则实际生产苗数=100万苗/年÷90%÷90%子=123.457万苗如果每瓶苗数为20苗，则实际生产瓶数=123.457万苗÷20苗/瓶≈6.173万瓶如果年增殖周期数为n=3，则每批须生产瓶苗=6.173万瓶÷3=2.058万瓶每架培养架为5台，每台长放17瓶，宽放7瓶，可放两层（5台/架×17瓶×7瓶×2层=1190瓶/架）则每批需培养架=2.058万瓶÷1190瓶/架=17.291架≈20架年产100万苗组培工厂所需面积1、摆放20架培养架的培养车间面积约需：（1.2m+0.6m间距）×（0.6m+0.6m间距）×20架=43.2m2≈50m220000瓶÷200瓶/天人÷25天=4人2、摆放4台超净工作台所需接种车间面积：接种间(1m+0.9m间距)×(0.7m+0.9m间距)×４台+缓冲间2.0m×1.5m=15.16m2≈20m23、配制与灭菌车间约需：30m24、其它（办公室等）：20m2四、年产100万苗组室的经费预算项目面积设备用具名称、数量单价（元）小计配制与灭菌车间30m2立式高压灭菌锅2台6500.0013000.00分析天平(0.1mg)1架4000.004000.00电子天平（0.01g）1架500.00500.00冰箱1台3000.003000.00药品5000.005000.00培养容器5万个0.8542500.00玻璃器皿800.00800.00其他小型实验用具1000.001000.00接种车间20m2超净工作台5台5000.0025000.00接种工具30套(三镊、两刀、一剪)120.003600.00灭菌器10个400.004000.00培养车间50m2培养架25架500.0012500.00空调1台4000.004000.00其它20m25000.005000.00房租费6000.006000.00改建费20000.0020000.00合计149900.00≈150000万元1、掌握组培实验室设计的基本原则：A、防止污染、控制污染、保证无菌操作。B、按照工艺流程科学设计，达到经济、实用和高效。C、结构布局合理，工作方便，节能、安全。D、规划设计与工作目的、规模及当地条件等相适应。2、了解组培实验室的总体要求：3、理解组培实验室的布局：根据生产流程布局，以提高工效和保证无菌。4、熟悉组培实验室的基本组成：准备室、接种室、培养室等5、熟悉组培实验室的基本设备：灭菌锅、超净台、培养架等6、了解组培实验室的组建经费预算：本章小结：课后作业•１、根据所学知识，设计一个面局1000平方，投资30万元左右的组织培养实验室。•（要求按比例绘制实验室布局图，把所需主要设备在布局图中绘出，并通过淘宝查询相关仪器设备用品价格，给出详细经费预算表。）1000元搞定一个家庭式袖珍的组培室你信不信？？？一、仪器设备及用具1、家用高压锅1个最好大一点的，装的东西多一点。用于培养基、无菌水等的消毒。（这个东西家家都有，可能不需要买吧？买的话是１００元左右）2、接种箱（无菌箱）1个，需要自己自制，用一些木板和一块玻璃和二尺布料，大约需要１０0元钱（抽油烟机罩改装也行）。3、药用天平1架最好是500g称量的，小一点也可以，大约100元，如果口袋里钱不够，就去药店你买一个称中药用的戥子，选称量100g的，最多只要10元钱。主要用来称琼脂、糖等物品。4、不锈钢锅或铝锅（煮汤、面条的那种）这个家家都有的，可以不去买。一定要买３０元搞定。5、搅拌和分装培养基用的调羹一个，就是在学校吃饭用的那种长柄的，用于煮制和分装培养基，一定要买5元搞定。6、培养用的瓶子若干，可以去买现成的，200ml带盖的0.60元一个，我最喜欢使用的就是医院里丢弃的200ml的盐水瓶,经济实惠，不要钱。7、牛皮纸、橡皮圈或棉线若干，用于包瓶头和扎包头纸用，牛皮纸可以去找用过的包装纸，橡皮圈或棉线一元钱买一大把。8、酒精灯1盏、解剖刀1把，刀片若干、镊子2把、10ml、100ml量筒各一个，2ml移液管1只（量筒和移液管可用针筒代替，药棉若干，加在一起要不了100元钱。以上仪器设备及用具合计：５００元二、基本药品药品只需购买以下几种就行了：1、MS培养基共19种，混合培养基90-150元/500g2、