BCA法测定蛋白质含量

蛋白质定量分析：BCA法实验分光光度计的基本原理是基于物质对不同波长的光的选择性吸收，不同的物质都有各自的吸收光谱。当白光通过某一溶液时，其中某些波长的光会被溶液吸收。光吸收程度达到最大值的波长，为最大吸收波长，用λmax示。分光光度计的基本原理Lambert－Beer定律A=KCL定义：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。1、只适用于单色光；λmax2、仅适用于稀释溶液；3、对于混合稀释溶液，应该尽量去除干扰物质；（空白管）4、A值控制在0.2～0.8之间。（A：吸光度；K：吸光系数；C：吸光物质的浓度；L：吸收层厚度）思考：根据该定律，如何计算待测物的浓度？Lambert－Beer定律的应用1.利用标准管计算测定管浓度(标准管法)用一已知浓度的测定物(标准管)按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据A=KCL计算。同一台仪器比色皿内径相同（L标=L测）,标准管和测定管为同一物质,吸光系数相同（K标=K测），A测=K测×C测×L测A标=K标×C标×L标C测=A测/A标×C标配制一系列的标准管，然后绘出标准曲线。再测出测定管的吸光度，在标准曲线上查找到对应浓度。浓度（C）时间:仪器型号:仪器编号:作图者:A2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）思考：试比较两种方法优缺点。A待测C待测1.预热打开电源开关，打开样品室，使仪器预热20分钟。2.调波长转动波长手轮，调至所需要的单色波长。3.调节T=0%调节功能键到“T”档，空白溶液、待测溶液依次放入样品室，使空白溶液对准光路，按下“0%”键，使数字显示为“0.000”。（此时样品室必须是打开的）4.调节T=100%把样品室盖子轻轻盖上，按“100%”键，使数字显示正好为“100.0”。5.调节A=0将功能键调节至“A”档,此时数字显示为“.000”。如果不是，则按T100（即A0键）6.吸光度测定拉动拉杆使待测液依次进入光路，读取A值。7.关机冲洗比色皿，关电源。使用步骤打开样品室盖，切断光路蛋白质定量BCA法什么是蛋白质？其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构与功能的关系？理化性质？如何分离纯化？定性？定量？BCA法是根据蛋白质什么性质？是什么或者有什么？有多少？为什么蛋白质可以定量测定？基于什么原理？呈色反应A=KCL，标准管法或者标准曲线法计算一.实验目的1、掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作；2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。二.实验原理BCA分子式BCA试剂盒在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+与两分子BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白质的含量。紫蓝色二.实验原理562nmA562∝M蛋白质二.实验原理采用标准曲线法计算待测液含量A待测m待测45°作图人：仪器型号：722型分光光度计时间：波长：562nmBCA法测定蛋白质含量标准曲线试剂盘摆放及移液管选择试剂盘摆放：试剂在左，移液管在右侧取试剂时，将试剂和相应的移液管拿出试剂盘，用完之后放回原处，谨防试剂污染。①②③④⑤①②③④⑤三.实验步骤取7支试管按下表编号并操作：（平行加样、准确量取）管号试剂（mL）空白管12345测定管标准蛋白溶液（0.3mg/ml）—0.10.20.30.40.5—蒸馏水3.02.92.82.72.62.52.5待测样品(小牛血清，已经稀释了500倍)——————0.5BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量(ug)306090120150将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。三.实验步骤1、以蛋白质含量为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量m,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。注意：最后浓度单位要统一换算成g/LC=mV——×500小牛血清正常范围为：30-50g/L原始数据管号空白管12345测定管m(ug)01530456075吸光度(A)仪器名称、型号编号：波长：测定日期：测定人：BCA法测定蛋白质含量四.注意事项1、实验分组，两人一组2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染3、准确量取试剂，正确使用吸量管4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等6、实验原始数据书写规范，三线表7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，BCA试剂盒BCA法广泛用于科研工作，其特点：1、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595nm的光吸值强碱性缓冲液TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响各种方法比较