实验一植物的组织培养

实验一植物的组织培养实验原理植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。组织培养的特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养不但是进行细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段；而且在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。培养基是植物组织培养中的主要部分，除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。培养基的种类很多，不同的培养基有其不同的特点。培养基的主要成分：水无机成分：无机大量元素氮：铵态氮、硝态氮混合磷：磷酸盐钾：钾盐钙、硫、镁无机微量元素主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。植物生长调节物质：生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D细胞分裂素类：BAP,KT，TDz，ZT其他类：GA3,ABA，PP333琼脂pH值配制培养基最方便的方法是预先配制不同组分的培养基母液，贮藏在冰箱，待配制培养基时取出，按比例稀释。配制母液时为了减少工作量可以把几种药品配在同一母液中，但是应该注意各种化合物的组合以及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应该注意加样顺序。铁盐单独配制，其配法为5.57g的硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）和7.45g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶于1L水中，用时每配1L培养基，取该溶液5ml。IAA、IBA、NAA等可用少量的乙醇溶解，然后在加水定容。2,4-D可用1N的NaOH溶解然后再定容；KT和6-BA应先定容于少量的1mol/L的HCl中，再加水定容。玉米素应该溶于95%的乙醇中再定容。pH值对培养基的凝固情况和植物材料的生长有很大的影响，因此，等培养基配好后，应该立即调整培养基的pH,最好用酸度计，既快又准。培养基配好后应该立即分装，体积一般为容器的1/4或者1/3为好。器材和药品高压蒸汽灭菌锅、洁净工作台、循环水式真空泵、电子天平、酸度测定仪、光照培养箱,搪瓷杯、搪瓷盘、100ml三角烧瓶（12个/组）、250ml三角瓶（2个/组）、试剂瓶、解剖刀柄与刀片、单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移液管、漏斗、量筒、烧杯（50、100、500、1000m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮筋、脱脂棉、滤纸、pH试纸（5.4-7.0）、标签纸、称量纸、药勺等。•次氯酸钠消毒液,75%的酒精,0.2％的升汞溶液.•1N盐酸,1NNaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖.0.1mg/ml的2,4-D溶液：取25mg的2,4-D，加入少量95%的酒精和1N的NaOH溶解，再加蒸馏水定容至250ml。•0.1mg/ml的6-BA溶液：取25mg的6-BA，用少量1N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250ml。MS培养基储备液的配制成分1升储备液用量（mg）每升培养基取用量（ml）20×储备液1（大量元素）NH4NO3KNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OKH2PO4330003800088007400340050200×储备液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O16612404460172050555200*储备液3（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O556074605200*储备液4（有机成分）肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸20000100100204005表.1MS培养基储备液的配制实实验步骤P培养基的配制11．母液配制：按照表1分别配制，并在4℃冰箱中保存。22.植物激素配制：称取10mgNAA,加入少量酒精，并加水定容50ml(浓度为0.2mg/ml),用同样的方法配制2，4-D母液。称取50mg6-BA,加少量的1mol/LHCl，使其充分溶解，然后加水至50ml(浓度为1mg/ml)。43．MS基本培养基的配制：分别吸取MS贮备液30.0ml（大量元素）、3.0ml微量元素、3.0ml铁盐、3.0ml有机,加入1L的搪瓷缸中，然后称取蔗糖18.0g,加入琼脂4.8g，加蒸馏水约550ml，在电炉上加热，煮沸，融化琼脂，然后加水至560ml。4.不同激素浓度培养基的配制：取200ml烧杯3个，分别吸取所需要的2,4-D溶液(0.5mg/L,1mg/L,2mg/L所需要的体积为：1.0，2.0,4.0ml)，然后加入MS基本培养190ml，搅拌均匀后，用10%的NaOH调节pH至5.8。加水定容至200ml。5.将配制好的培养基分装于50ml三角瓶中，盖上封口膜，并用牛皮纸包扎。操培养基灭菌11.打开灭菌锅盖，向锅内加水。22.加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。33.加盖旋紧螺旋。44.打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升。55.待压力逐渐上升到所需压力时（一般为15磅/时，1.034×105Pa）,灭菌20分钟。6．灭菌后，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。胡萝卜组织培养1.取两个50ml的小烧杯,分别倒入25ml的70%的酒精和0.2%的升汞。2.取胡萝卜贮藏根，洗净，然后将胡萝卜根于70％酒精中浸泡数秒钟。3.浸于0.2％氯化汞（升汞）液中消毒灭菌10min后,再用无菌水冲洗3—4次。4.将灭菌材料放在灭菌的滤纸上,吸干水分。5.用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层，切成0.5cm见方的小块，接种于MS附加2.0mg/L2，4-D培养基内,于25℃，黑暗或漫射光下培养,14—21天后继代一次。水稻成熟胚组织培养1.取成熟种子，用70％乙醇浸lmin，转至l.5％次氯酸钠溶液（含有0.01%吐温20）浸泡l.5—2h后，用无菌水冲洗4～5次，置无菌滤纸上吸干多余水分。2.将成熟胚置于含2mg／L2，4－D的MS固体培养基上，27℃暗培养诱导愈伤组织10天后（成熟胚）继代一次。注意事项：1.配制培养基时，一定要注意调节pH。2.外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。结果外植体经过20天的培养后，长出淡黄色的愈伤组织。思考题1，植物组织培养的理论基础是什么？2，培养基的成分主要有那几类？