第二章DNA重组技术与基因操作

第二章DNA重组技术与基本操作限制性内切酶克隆载体重组基因的导入和筛选获得真核生物目的基因的方法基因工程研究的理论依据不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代DNA重组技术要有四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞DNA限制性内切酶可分为三类：Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅠ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用,why?第一节限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。Ⅰ、Ⅲ限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份2种不同的亚基切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割能能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大一、II类限制性内切酶的特点识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4、5或6个核苷酸且呈二重对称，但有少数酶识别更长的序列或兼并序列；具有特定的酶切位点，产生出特定的酶切末端→5’突出粘末端、3’突出粘末端、平末端；Ⅱ类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统；限制性内切酶、独立的甲基化酶。被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做粘性末端。EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段SmaⅠ特异识别CCCGGG,形成平末端5’CCCGGG3’GGGCCC5’CCCGGGGGG3’CCC＋二、使用限制性内切酶时应注意的问题1、仔细查阅酶的识别序列和切割位点。同裂酶：不同来源但是识别同样顺序和相同切割位点的限制性内切酶。同尾酶：有时有两种限制性内切酶识别不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所产生的粘性末端却相同，这类酶为具不同酶切位点的DNA片段重组提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA连接酶连接后，都不能再被其切割了。2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生staractivity的原因。staractivity：指当酶的反应条件改变时，其在识别序列中的酶切位点发生改变。产生的原因：反应体系中甘油的浓度12％；酶：DNA比率25u/μg；缺少Nacl和存在Mn2＋。4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。一般以在20μl反应体积中，37℃，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。5、注意酶在保温过程中的活性变化。ACCⅠ在5小时内具有全部活力BamHⅠ在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。CfoⅠ仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。三、连接酶定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。用途：（1）、连接带匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。→这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。四、修饰酶1、DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment）、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶、耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反转录酶、末端脱氧核苷酸转移酶等2、依赖于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶用途:在invitro条件，合成单链RNA作为杂交探针。3、T4噬菌体多核苷酸激酶：催化ATP的γ－磷酸基转移至DNA或RNA片段的5’末端。用途：标记DNA片段的5’端，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于测序引物的5’标记。5’HOOH3’HOOH3’5’5’突出末端5’隐蔽末端5’32POH3’HO32P3’5’γ32PATP4、碱性磷酸酶：用途：去除DNA片段5’末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率；在用［γ－32p］ATP标记DNA或RNA的5’末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5’磷酸。5’POH3’HOP3’5’5’突出末端5’隐蔽末端OHHO5’HOOH3’3’5’第二节克隆载体基因工程载体应具备的条件：能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制；具有合适的限制性内切酶位点：在载体上单一的限制性酶切位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便的插入载体；在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增；载体的分子量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段：在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失；应该有一个或多个选择标记。大肠杆菌表达载体应具备：强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录；在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）；在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。一、质粒(plasmid)定义：质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。AOCSCLF质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。1、质粒载体pBR322特点1）大小为4363bp；2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；3）有单一的BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的识别位点（在四环素抗性基因内）、PstⅠ识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）；外源片段在BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体。4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322以高拷贝数存在。2、质粒载体pUC191）特征大小为2686bp；带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因；一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因的调节片段（lacZ’）,一个调节lacZ’基因表达的阻遏蛋白的基因lacI；含有多个单克隆位点。2）pUC19的筛选：培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操纵子的一个诱导物）时，lacI的产物就不能与lacZ’的启动子区域结合，质粒pUC19的lacZ’就可以转录，进而翻译，lacZ蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合β－半乳糖苷酶。在底物5－溴－4氯－3吲哚－β－半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal会被杂合β－半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源DNA序列的pUC19质粒克隆就呈蓝色。由于pUC19的单克隆位点的序列是整合在lacZ’之中的，若pUC19质粒中插入有目的DNA片段，就会破环lacZ’的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无法形成杂合的β－半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。穿梭质粒:人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。二、λ噬菌体①λ噬菌体可以进入裂解循环，20分钟后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约100个噬菌体颗粒。②λ噬菌体也可以进入溶源循环，即注入的DNA整合到大肠杆菌的染色体中，以前噬菌体的形式潜伏起来，永久保留。③λ噬菌体DNA大约长50kb，其中大约20kb对于整合／切割过程极为关键，称为整合／切割（I/E）区域。对于构建文库，可将这20kbDNA片段去掉，强迫重组的λ噬菌体进入裂解循环。整合／切割区域尾部基因头部基因粘性末端粘性末端负责DNA复制的基因细胞裂解基因λ噬菌体的DNA示意图左臂右臂④λ噬菌体头的大小足以装下50kb单元的线性DNA，DNA38kb，噬菌体没有侵染性；DNA52kb,则无法包装进头部。⑤cos位点（cossite）就是保证在超长线性DNA分子上每两个cos位点之间为50kb,使DNA分子能正确的装配进噬菌体。在头的入口处有一种酶，它能识别双链线性DNA分子上的cos序列，并在cos序列处切断DNA分子，使适当大小的DNA进入噬菌体的头部。λ噬菌体DNA分子示意图三、柯斯质粒（cosmid）可携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，→综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优势。柯斯质粒上带有多个单克隆位点、两个cos位点、DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间含有一个限制性内切酶位点（RE）。应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序利用柯斯质粒克隆大片段DNA四、YAC载体1、目前能容纳最大外源DNA片段的载体是YAC（酵母人工染色体，yeastartificialchromosome）。2、真核生物染色体三个关键部分：着丝粒（centromere,CEN）,它主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各子细胞中；端粒（telomere,TEL）,位于染色体的末端，对染色体末端的复制以及防止染色体被核酸外切酶切断具有重要的意义；自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）,即在染色体上的多处DNA复制起始位点。3、作为真核基因表达载体应具备如下条件：①含有原核基因的复制起始序列（如ColE1起始序列ori）筛选标记；②含有真核基因的复制起始序列（如SV40病毒的复制序列、酵母的2μ质粒的复制起始序列ARS、以及真核细胞筛选标记（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母细胞中与自养有关的基因））；③含有有效地启动子序列（可包含增强子序列等各种顺式作用元件）；④RNA聚合酶所需的转录终止和poly(A)加入的信号序列；⑤合适的供外源基因插入的限制性内切酶位点。4、YAC的主要功能成份有三：1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减数分裂同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。4）构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，选择标记，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。pYAC4结构图第三节重组基因的导入和筛选DNA克隆的基本过程1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体基因工程技术策略分：基因载体目的基因质粒噬菌体病毒直接分离cDNA人工合成基因文库切：限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交基因操作的基本步骤1、细胞内总DNA的提取分离细胞内总DNA的提取分离程序紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。2、基因重组的方法：1）根据外源DNA片段末端的性质同载体上适当的酶切位点相连实现基因的体