五子衍宗方对雄性小鼠生殖能力促进作用的系统评价

1五子衍宗方对雄性小鼠生殖能力促进作用的系统评价许芮豪摘要男性精液质量和男性生育力呈下降趋势是全球性的普遍现象，不孕不育已经成为一种新的常见病。对男性生育力/精液质量的正向干预研究重要意义。大量的临床实践和研究报告证实，五子衍宗丸在男性精液质量和男性生育力促进方面具有明确的作用，但有关机制尚未明确。本研究通过对NIH、ICR、Balb/c雄性小鼠白消安无精子模型的动物实验，造模后给予2个生精周期的中药处理，以生精干细胞为靶标，对经典方剂五子衍宗方的中成药、单味药和单味药的有效成分提取物纯品分别分为高中低3个剂量组，进行系统综合评价，通过动物外观肾虚型症状表现、组织重量、精子质量、睾丸组织形态学、c-Kit、Oct4、SCF、Bcl-2、Bax、Ki67免疫组织化学技术和生精干细胞的评价、基因芯片技术、mRNA表达、蛋白表达等指标分析，显示五子衍宗方不同药品，均具有促进生精能力和精子质量提高的明确作用；睾丸组织生精/生精干细胞相关基因mRNA的检测结果显示，五子衍宗丸方可以调控SCF、c-kit基因的表达。全方、单味和提取物纯品的量效关系正在进行深入的研究。结论，五子衍宗方对精子质量/生精细胞/生精干细胞具有明确的正向促进作用关键词：五子衍宗丸，生精干细胞，精子质量，精子生成，补肾药全球范围内，人类精液质量随着环境质量的变化呈现普遍下降的趋势引起极大关注（1992，丹麦，E.Carlsen和A.Giwercman）。本课题组的研究表明：我国男性精子数目以每年1%的速度下降，工业化程度越高的地区降低越快，具有在青壮年人群中更加下降快的特点（1999,2002,2008,2003，张树成），导致男性生育力明显减低，男性不育患者明显增加。对于男性精液质量的促进，西医的方法多以激素及其类似物为主，手段有限，而传统中医药在治疗精液质量异常所导致的男性不育时中医中药具有特殊优势。2中医对“精”的理解有多重内容，除了对男性生殖的含义外，包含人体正气的基本和根本。西方医学的“生精”作用是狭义的精子生成过程，是实验手段可科学的观察和认识的过程。中医生精内涵的广义，正式强调了整体调节的意义，而不单拘泥于某一细节。在治疗上强调个性化，辨证施治，针对病人不同的整体情况选用不同的手段和方药而达到改善生育力的目的。最终的临床治疗效果，是中西医学共同追求的目标。因此，精子生成是可通过实验手段认知的过程，提供了中医观察生“精”效果的可实验观察的指标。五子衍宗方是中医男科精华中的经典名方，对男性不育症有较好的疗效，成为补肾生精的经典方剂，临床上大量有效方剂多以此为基础化裁形成。本课题组的研究思路是：以生精干细胞为靶点，将诱导、激发和促进成体组织中“潜伏”的干细胞活性这一新的概念用于到补肾药干预效果的评估，通过生精障碍动物模型，对经典方剂五子衍宗方的中成药、单味药、单味药的有效成分提取物纯品进行系列试验评价。传统中医药宝库是我国开展生殖健康研究的特有资源和先天优势。开展中医药与男性生殖健康方面的研究是我国人口与健康发展战略的需要，是社会发展的重大需求。将现代干细胞前沿理论的思想，引入到传统中医中药体系中，对生精干细胞具有正向调节作用的五子衍宗方的系统机制认识，并应用于临床加以验证。材料和方法1.实验动物：无特定病原菌(SPF级，三级动物)成年10～12周龄NIH、ICR、Balb/c三个品系雄性小鼠。2.主要试剂：五子衍宗丸(批号4030124，北京同仁堂)，白消安（Sigma），二甲基亚砜(DMSO，Axygen)，TRIZOL（Invitrogen）；菟丝子、覆盆子、车前子、枸杞子、五味子的5种饮片（北京同仁堂药店）；菟丝子黄酮、覆盆子酮、车前子皂苷、枸杞多糖、五味子素（陕西森弗药业公司）。3.动物模型：采用白消安无精子症动物模型，30mgkg－1单次腹腔注射给药不同品系动物，40天后，存活动物造模成功。4.实验方法：将模型动物，分为中药高中低剂量组（成人临床等效剂量3换算剂量），连续灌胃给药不同中药品78d(2个小鼠生精周期)，为高中低实验组；灌胃给纯净水为自然恢复对照组（阴性对照组）。以溶媒对照动物，灌胃给纯净水为溶媒对照组；以正常动物为正常对照组（阳性对照组）。进行第2种品系动物的重复性试验。5.观察指标和方法1）有动物最后1次给药24h后，称体重，断脊处理，取出双侧睾丸和附睾前列腺储精囊会阴复合体。一侧的睾丸和附睾固定于Bouin液中。2）另一侧附睾组织，采用附睾头-培养基泳动法进行精子质量观察精子活力、活动率和精子数目。3）另一侧睾丸，迅速液氮冷冻后，于－80℃冰箱中保存，用于分子生物学指标测试。4）组织学观察：常规石蜡包埋，5m切片，HE染色，封片，镜检观察。5）免疫组化采用睾丸横切面石蜡切片（5μm）常规方法，DAB显色剂显色，苏木精复染核，脱水透明，封片。6）免疫组织化学染色：采用人工分析和显微图像拼接合成技术，使用Image-ProPlus软件进行图像分析。7）Real-timePCR反应采用常规技术进行。PCR反应程序（二步法），40个循环。6.统计学处理：采用计算机统计软件进行数据处理，结果以均值±标准差表示。结果对NIH、ICR、Balb/c3个品系小鼠试验，取得一致结果，确认。1.动物外观体征表现：造模后动物整体表现为明显虚弱，体重开始减轻，明显怕冷，脱毛，乏力蜷卧、皮毛卷曲、竖毛皱绺、皮毛无光泽、多尿等。中药实验组明显好于自然恢复组，动物机体活力增强、肾虚型外观体征明显改善的作用。2.生殖器官组织重量：睾丸和附睾组织，在中成药、5种饮片和提取物纯品的3个剂量组，均表现为比自然恢复组（阴性对照组）明显增加，分别增加120%～65%、55%～30%和80%～30%，其中。中成药达到正常对照组（阳4性对照组）的85%～40%。3.附睾精子质量：造模动物显示精子数目均为无，说明造模成功。造模后2个生精周期，有活精子的动物数在自然恢复组为15～20%，在中成药、5种饮片和提取物纯品的3个剂量组，分别为100%～80%、70%～40%和100%～50%，表明精子生成能力明显提高。精液质量指标，精子计数、精子活动率、优秀活动精子率在中成药、5种饮片和提取物纯品的3个剂量组均有不同程度的提高或明显提高。4.睾丸组织形态学：造模后，证实造模成功，显示整个睾丸组织严重萎缩，极度退化变性，管腔空泡化，仅见极少的散在生精细胞；间质组织退化，细胞排列紊乱，总体表现完全丧失生精能力。实验组组织形态学整体表现评价，与附睾精子质量检测结果一致，中药组均具有不同程度的生精功能恢复，促进生精能力明显提高，但是均没有恢复到（达到）正常小鼠的水平。以精曲小管的“完整性”和生精上皮细胞的基本结构评价睾丸内精子发生/精子生成的能力。自然恢复组，5%～15%左右的精曲小管生精上皮达到1～3层，无完整形态管腔，提示精子生成能力尚未恢复。中成药组，可见80%～90%左右的精曲小管完整管腔，达到5层以上，提示精子生成能力接近正常水平。中药饮片组，可见35%～70%左右的精曲小管完整管腔，达到3～5层以上，提示精子生成能力恢复20%～50%左右。提取物纯品组，可见50%～30%左右的精曲小管完整管腔，达到3～5层以上，提示精子生成能力恢复35%～65%左右。5.组化和生精干细胞的评价：采用多种标记物人工和图形分析技术分析。显示，中成药、5种饮片和提取物纯品的3个剂量组，生精干细胞均比自然恢复组明显提高。见图1。图1.c-kit阳性细胞计数和图形分析技术6.睾丸全基因芯片分析：五子衍宗丸与对照组相比，发现明显上调和下调基因分别355和487个，信号通路分析(Pathway分析)上调差异基因主要表5现在9个包括粘附功能、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体作用、Hedgehog信号通路、Jak-Stat信号通路、Mapk信号通路、Notch信号通路、Toll样受体信号通路、Wnt信号通路系统；下调的差异基因主要集中在化学信号途径、泛素介导的蛋白水解、核糖体、胞质DNA的传感途径、白细胞跨内皮细胞迁移通路等。7.睾丸组织中bcl-2、c-kit、SCF基因的mRNA表达：免疫组织化学分析结果显示方药可以显著性的增加生精上皮中c-kit和Oct-3/4的阳性细胞量，促进生精干细胞增加。利用Real-timePCR技术，对基因水平的测试分析。结果显示自然恢复对照组SCFmRNA相对表达量明显低于五子衍宗丸组（P﹤0.004），表明五子衍宗丸能够显著提高SCFmRNA的转录水平。自然恢复对照组c-kitmRNA相对表达量明显低于五子衍宗丸组（P﹤0.0107），显示五子衍宗丸能够显著提高SCF的转录水平。五子衍宗对Bcl-2、Bax（细胞凋亡）和SCF、Ki67（增殖）基因的调控作用的检测，正在进行中。中药饮片和提取物纯品对睾丸生精能力的促进作用的相关基因的mRNA和蛋白表达试验，也正在总结中。讨论干细胞研究近来成为前沿“热点”领域。五子衍宗方是临床提高精液质量以治疗男性不育常用的经典中药，相关的研究多集中在临床疗效的评价方面，缺少相关作用机制方面的基础研究。本研究结果显示五子衍宗丸不仅可以改善小鼠体质量生殖器官组织质量和指数附睾精子质量(活动率活动力和浓度)等与生殖作用相关指标，而且可以刺激小鼠睾丸生精上皮细胞的活化，对生精能力的促进作用。