DB12T 652-2016 转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品 种定性检测实时荧光

ICS67.050B23天津市地方标准DB12DB12/T652—2016转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测实时荧光PCR法Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—QualitativePCRmethodforherbicide-resistantsoybeanDAS-68416-4anditsderivates2016-09-27发布2016-11-01实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T652—2016I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、李亮、赵新、刘雪岩、宛煜嵩、王成、陈锐、朱珠、刘娜、徐石勇。本标准2016年9月首次发布。DB12/T652—20161转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种定性检测实时荧光PCR法1范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性的定性PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品种，以及制品中DAS-68416-4转化体成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告—8—2013转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR法农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求3术语和定义农业部2031号公告—8—2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin基因Lectingene编码大豆凝集素的基因。3.2DAS-68416-4转化体特异性序列event-specificsequenceofDAS-68416-4DAS-68416-4外源插入片段5′端与大豆基因组的连接区序列。4原理根据转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性序列设计特异性引物，对试样DNA进行PCR扩增。依据是否扩增获得典型的实时荧光扩增曲线，判断样品中是否含有DAS-68416-4转化体成分。5检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1.1TaqMan荧光定量PCR反应试剂盒。5.1.2引物和探针。DB12/T652—201625.1.2.1Lectin基因。lec-1215F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′lec-1332R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′lec-1269P：5′-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3′预期扩增片段大小为118bp（参见附录A）。5.1.2.2DAS-68416-4转化体特异性序列。DAS-68416-4-F：5'-GGGCCTAACTTTTGGTGTGATG-3'DAS-68416-4-R：5'-TACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATT-3'DAS-68416-4-P：5'-HEX-TTCAAGCACCAGTCAGCAT-MGB-3'预期扩增片段大小为128bp（参见附录A）。用水分别将上述引物和探针稀释到10µmol/L。探针需避光保存。5.2仪器分析天平：（感量0.1g和0.1mg）；荧光定量PCR扩增仪；核酸定量仪；重蒸馏水发生器或纯水仪；其他相关仪器设备。5.3分析步骤5.3.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.2试样准备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.4DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.5PCR反应5.3.5.1标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。DAS-68416-4转化体实时荧光PCR反应按表1在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；Lectin内标基因实时荧光PCR反应按表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。将PCR管放在离心机上，500g~3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。运行实时荧光PCR反应。反应程序为：94℃变性5min；进行45次循环扩增反应（94℃变性15s，60℃退火延伸1min）；在第二阶段的退火延伸（60℃）时段收集荧光信号。（可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。）DB12/T652—20163表1DAS-68416-4PCR反应体系试剂终浓度体积TaqMan反应缓冲液1×—10µmol/LDAS-68416-4-F0.8µmol/L2.0µL10µmol/LDAS-68416-4-R0.8µmol/L2.0µL10µmol/LDAS-68416-4-P0.4µmol/L1.0µLDNA模板2.0µL无菌水—总体积25.0µL根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“—”表示体积不确定。根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0µL。表2Lectin内标基因PCR反应体系试剂终浓度体积TaqMan反应缓冲液1×—10µmol/Llec-1215F0.2µmol/L0.5µL10µmol/Llec-1332R0.2µmol/L0.5µL10µmol/Llec-1269P0.2µmol/L0.5µLDNA模板2.0µL无菌水—总体积25.0µL根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“—”表示体积不确定。根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0µL。5.3.5.2设置对照在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因大豆基因组DNA作为阴性对照；以耐除草剂大豆DAS-68416-4质量分数为0.1%~1.0%的基因组DNA（或采用大豆DAS-68416-4与非转基因大豆基因组相比的拷贝数分数为0.1%~1.0%的DNA溶液）作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与5.3.5.1相同。6结果分析与表述6.1Lectin内标准基因无典型扩增曲线，表明样品中未检出大豆成分，结果表述为“样品中未检测出大豆成分，检测结果为阴性”。6.2Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且Ct值≤38；同时DAS-68416-4转化体特异性序列出现典型扩增曲线，且Ct值≤38，表明样品中检测出DAS-68416-4转化体成分，结果表述为“样品中检测出转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体成分，检测结果为阳性”。DB12/T652—201646.3Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且Ct值≤38；但DAS-68416-4转化体特异性序列未出现典型扩增曲线，表明样品中未检测出DAS-68416-4转化体成分，结果表述为“样品中未检测出转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体成分，检测结果为阴性”。6.4Lectin内标准基因和/或DAS-68416-4转化体特异性序列出现典型扩增曲线，但Ct值在38～40之间，进行重复实验。如重复实验结果符合6.1～6.3的情形，依照6.1～6.3进行判断。如重复实验检测参数出现典型扩增曲线，但检测Ct值仍在38～40之间，则判定样品检出Lectin内标准基因和/或转化体特异性序列，根据检出参数情况，参照6.1～6.3对样品进行判定。DB12/T652—20165附录A（资料性附录）A.1Lectin基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（AccessionNo.K00821）1GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTC61GCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC注：划线部分为lec-1215F和lec-1332R引物序列，方框内为探针lec-1269P序列。A.2耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性序列1GGGCCTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGACTGGTGCTTGAATGATTTAAAAATAAATTTT61TAATTTAGTTGTAACAAGTTTTAAGTATTTTTTTATATTAATTTATTGCATTACGACAGA121AGCAAGTA注1：划线部分为DAS-68416-4-F和DAS-68416-4-R引物序列，方框内为探针DAS-68416-4-P序列。_________________________________