DB13T 2609-2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法

ICS65.020.30B41DB13河北省地方标准DB13/T2609—2017禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2609—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、李丽敏、白云、韩庆安。DB13/T2609—20171禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法1范围本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。2缩略语下列缩略语适用于本文件。EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）3试剂或材料包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0％琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix。警示:氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。3.2氯仿:又名三氯甲烷。3.31.0％琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.450×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。3.5溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.6焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。3.7DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。3.8反转录酶:M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）。DB13/T2609—201723.9RNA酶抑制剂。3.102×TaqMasterMix:含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。3.11dNTP。浓度为2.5mM。3.12引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。4仪器设备4.1PCR仪:温度范围4.0℃～99.9℃,样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。4.2凝胶成像系统:检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。4.3台式低温高速离心机:最高转速16000r/min；容量1.5mL×12。4.4电泳仪:电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。4.6冰箱:具有冷藏功能。4.7微量移液器:单道可调,量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL～1000μL。4.8水浴锅:温度范围为室温～100℃。5样品5.1阴阳性对照以灭活的禽流感病毒与新城疫病毒鸡胚培养物或者感染禽组织作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。5.2样品的采集与处理5.2.1采集工具下列的采集工具应经121℃±2℃，20min高压灭菌并烘干：a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1.5mL离心管；e)研钵。5.2.2棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。5.2.3组织采集DB13/T2609—20173剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。5.2.4样品储运样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24h内送至实验室。5.2.5样品的处理5.2.5.1棉拭子处理方法将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。5.2.5.2组织的处理方法将所采集的组织至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。6操作步骤6.1RNA的提取6.1.1用LSTRIzol试剂提取待检样品（棉拭子或组织）、阳性对照及阴性对照样品的RNA。6.1.2将250μL经过预处理的待检样品（棉拭子或组织）加入750μLTRIzolLSReagent中，振荡2min，室温放置5min。6.1.3加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min，室温放置5min后，4℃条件下12000r/min离心15min。6.1.4吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置15min，4℃条件下12000r/min离心15min。6.1.5小心吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇700μL～800μL，4℃条件下12000r/min离心5min。6.1.6小心吸弃上清，将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，加适量的DEPC水溶解。6.1.7提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。6.1.8也可采用商品化的病毒核酸提取试剂，按照说明书进行如下操作。同时进行阴阳对照样品RNA的提取。6.1.8.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL离心管中，在离心管中加入200μL样品，加入200μLBB5，涡旋混合15s，56℃孵育15min。6.1.8.2加入250μL无水乙醇，涡旋混合15s，室温放置5min。6.1.8.3将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000r/min离心1min，弃掉流出液。6.1.8.4加入500μLWB5，12000r/min离心1min，弃掉流出液，重复一次。DB13/T2609—201746.1.8.5室温12000r/min离心1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置1～3min彻底晾干离心柱。6.1.8.6将离心柱转入1.5mL离心管中，并向离心柱中央加20μLRNase-freeWater，室温静置1min。6.1.8.7室温12000r/min离心1min，洗脱RNA。6.1.8.8提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。6.2RT-PCR6.2.1反转录反应（cDNA的合成）取上述步骤所得的RNA11μL，加入2μL10µmol//L的反转录引物（AIV/NDV-RT），4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1h，即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR扩增或-20℃冻存备用。6.2.2PCR反应在反应管中依次加入8μL无核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述cDNA溶液、各0.5μL10µmol/L的上游引物（AIV-decF与NDV-decF）、各0.5μL10µmol/L的下游引物（AIV-decR与NDV-decR）。经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。7试验数据处理7.1扩增产物的电泳检测制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100bp）。恒压（110V）电泳30min～40min，将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。7.2结果判定阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带，阴性的扩增产物没有预期的目的条带，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp位置出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒核酸检测阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在297bp位置出现特异性的条带，则判定为新城疫病毒核酸检测阳性。如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp和297bp位置均出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp和297bp位置均未出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阴性。RT-PCR产物电泳图见附录C中C.1。8试验报告依次陈述试验对象、所使用的标准（包括发布或出版年号）、所使用的方法、检测结果与试验时间等。DB13/T2609—20175AA附录A（规范性附录）相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g，放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）称取EDTA18.61g，加灭菌双蒸水至100mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液（50×）Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加灭菌双蒸水至1000mL。A.3溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg，加灭菌双蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加灭菌双蒸水至100mL，室温放置6h～8h，121℃±2℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.5PBS缓冲液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·127H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制：A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL。DB13/T2609—20176BB附录B（规范性附录）引物表B.1规定了引物的浓度和序列。表B.1引物的浓度和序列引物名称引物浓度序列（5'-3'）AIV-decF10μmol/LCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCAIV-decR10μmol/LGTCCTCATTGCCTGCACCATCNDV-decF10μmol/LCGAAGAGCCCGTTAGTCAAATCNDV-decR10μmol/LGTATCTTGGCAACCTGGGGAGAIV/NDV-RT10μmol/LAGCAAAAGCAGGDB13/T2609—20177CC附录C（规范性附录）禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR产物电泳图说明：M——DNA分子量标准（100bp）；1——阴性对照；2——禽流感病毒与新城疫病毒双阳性对照；3——新城疫病毒阳性对照；