您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 行业资料 > 国内外标准规范 > DB41T 987-2014 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程
ICS65.020B16DB41河南省地方标准DB41/T987—2014脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberorseedling2014-12-30发布2015-03-01实施河南省质量技术监督局发布DB41/T987-2014I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12术语和定义........................................................................12.1脱毒组培苗....................................................................12.2扩繁苗........................................................................12.3脱毒种薯(苗)................................................................12.4原原种........................................................................12.5原种..........................................................................12.6大田用种......................................................................12.7允许带毒率....................................................................22.8允许病毒显症率................................................................23检测对象..........................................................................24抽样..............................................................................24.1组培苗抽样....................................................................24.2田间抽样......................................................................25检测方法..........................................................................25.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法...............................25.2指示植物检测法................................................................35.3聚合酶链式反应(PCR)检测法...................................................35.4反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法..........................................36脱毒种薯(苗)的检测程序及质量要求................................................36.1脱毒组培苗....................................................................36.2原原种........................................................................36.3原种..........................................................................36.4大田用种......................................................................3附录A(规范性附录)硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法.................4附录B(规范性附录)指示植物检测法..................................................6附录C(规范性附录)聚合酶链式反应(PCR)检测法.....................................7附录D(规范性附录)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法............................9DB41/T987-2014II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河南省农业科学院提出。本标准起草单位:河南省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:张振臣、乔奇、秦艳红、张德胜、王爽、田雨婷、王永江。DB41/T987-20141脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程1范围本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测的术语定义、检测对象、抽样、检测方法和脱毒种薯(苗)的检测程序及质量要求。本标准适用于脱毒甘薯种薯(苗)的病毒检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1脱毒组培苗virus-freetissuecultureseedling利用茎尖分生组织培养技术获得的再生组培苗,经检测,确认不含甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(Sweetpotatolatentvirus,SPLV)、甘薯G病毒(SweetpotatovirusG,SPVG)、甘薯病毒2(Sweetpotatovirus2,SPV2)、甘薯褪绿斑病毒(Sweetpotatochloroticfleckvirus,SPCFV)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweetpotatochloroticstuntvirus,SPCSV)和甘薯卷叶病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus,SPLCV)的种苗。2.2扩繁苗propagationseedling由脱毒组培苗在无菌条件下或者防虫温(网)室内快繁后得到的甘薯苗。2.3脱毒种薯(苗)virus-freeseedtuberorseedling由脱毒组培苗经逐代繁殖增加种薯(苗)数量的种薯(苗)生产体系生产出来的种薯(苗)。分原原种、原种、大田用种三个级别。2.4原原种pre-elite用脱毒组培苗或扩繁苗在防虫网室内生产出的符合质量要求的种薯(苗)。2.5原种elite用原原种作种薯,在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯(苗)。2.6大田用种certifiedseed用原种作种薯,在隔离条件下生产出的符合质量要求的种薯(苗)。2.7允许带毒率permissionvirus-carryingrate各级甘薯种薯(苗)繁殖田中允许携带病毒植株的比率。2.8允许病毒显症率permissionvirus-symptomrateDB41/T987-20142各级甘薯种薯(苗)繁殖田中允许出现病毒病症状植株的比率。3检测对象甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV);甘薯潜隐病毒(SPLV);甘薯G病毒(SPVG);甘薯病毒2(SPV2);甘薯褪绿斑病毒(SPCFV);甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV);甘薯卷叶病毒(SPLCV)。4抽样4.1组培苗抽样4.1.1脱毒组培苗每株均应检测。4.1.2扩繁苗随机抽取1%~2%的扩繁苗检测。4.2田间抽样4.2.1原原种田抽样定植后30d、60d、收获前2周,在目测的基础上,采用五点取样法。面积≤0.1hm2,抽取数量为200株;0.1hm2<面积≤1hm2,抽取数量为500株;每超出1hm2面积,划出另一检验区,按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片1g~5g,-20℃以下低温保存。4.2.2原种田和大田用种田抽样定植后30d、收获前两周,在目测的基础上,采用五点取样法。取样方法及样品保存同4.2.1。5检测方法5.1硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法用于检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒,检测法见附录A。5.2指示植物检测法用于辅助检测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7种病毒,检测法见附录B。5.3聚合酶链式反应(PCR)检测法用于检测SPLCV。检测法见附录C。DB41/T987-201435.4反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法用于检测SPCSV。检测法见附录D。6脱毒种薯(苗)的检测程序及质量要求6.1脱毒组培苗样品同时利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4种方法进行检测,4种方法的检测结果均应为阴性,即允许带毒率为0。6.2原原种先目测调查样品的病毒显症率,然后利用NCM-ELISA或指示植物法进行检测,至少其中10%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。允许带毒率为0,允许病毒显症率为0。6.3原种先目测调查样品的病毒显症率,然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测,至少其中5%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤2.0%,SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0。允许病毒显症率≤1.0%。6.4大田用种先目测调查样品的病毒显症率,然后利用NCM-ELISA或指示植物进行检测,至少其中1%的样品分别利用PCR和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允许带毒率≤10.0%,SPCSV和SPLCV的允许带毒率为0,允许病毒显症率≤5.0%。DB41/T987-20144AA附录A(规范性附录)硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测法A.1溶液配制除非另有规定仅使用分析试剂。水为无菌蒸馏水。A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]:称取60.60g的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于300mL无菌蒸馏水中,加入32.5mL浓盐酸(HCl),调节pH值为7.5,定容至500mL。4℃保存备用。A.1.2氯化钠溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]:称取292.20g氯化钠,在800mL无菌蒸馏水中,溶解定容至1L。4℃保存备用。A.1.3三羟甲基氨基甲烷溶液(TBS):分别取1mol/LTris-HCl(A.1.1)20mL和5mol/L氯化钠(A.1.2)100mL,混合后用无菌蒸馏水定容至1L。A.1.4洗涤缓冲液(TBST):0.5mL吐温-20(Tween-20)溶于1LTBS(A.1.3)中。A.1.5抽提缓冲液:称取亚硫酸钠(Na2SO3)0.20g溶于TBS(A.1.3)中,定容至100mL。A.1.6封闭缓冲液:称取脱脂奶粉0.50g,分别量取曲拉通(Triton)X-1000.5mL和TBS(A.1.3)25mL。先将脱脂奶粉溶于少量
本文标题:DB41T 987-2014 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程
链接地址:https://www.777doc.com/doc-8716011 .html