DBS22 008-2012 食品安全地方标准 乳与乳制品中L-羟脯氨酸的测定

DBS22吉林省地方标准DBS22/008—2012食品安全地方标准乳与乳制品中L-羟脯氨酸的测定2012-12-10发布2013-01-01实施吉林省卫生厅发布DBS22/008—2012I前言本标准的附录A为资料性附录。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：李青、方赤光、刘思洁、张冠英、王蕴馨。DBS22/008—20121食品安全标准乳与乳制品中L-羟脯氨酸的测定1范围本标准规定了乳与乳制品中L-羟脯氨酸的分光光度、高效液相色谱、液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于乳与乳制品中L-羟脯氨酸的测定。本标准方法的检出限为：分光光度法为20mg/kg；高效液相色谱法为0.5mg/kg；液相色谱-串联质谱法为0.005mg/kg。第一法分光光度法2原理试样用硫酸水解，L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲氨基甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处测定吸光度并与标准比较定量。3试剂和材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的三级水。3.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]：取375mL水于1L量筒中,搅拌下缓慢加入160mL浓硫酸,冷却至室温后用水定容。3.2柠檬酸缓冲液(pH=6.8)：称取26.0g柠檬酸、14.0g氢氧化钠和78.0g无水乙酸钠,溶于500mL水,转入1L容量瓶中,加入250mL正丙醇,用水定容到刻度。3.3氯胺T溶液：称取1.41g氯胺T,用100mL缓冲溶液(4.2)溶解。临用现配。3.4显色剂：称取10.0g二甲氨基甲醛,用35mL高氯酸(60%质量分数)溶液或30mL高氯酸(70%质量分数)溶液溶解,缓慢加入65mL异丙醇。临用现配。3.5氢氧化钠溶液(200g/L)：称取100g氢氧化钠于500mL量筒中,搅拌下缓慢加水至400mL,冷却至室温后用水定容到500mL。3.6标准储备液：称取50mgL-羟脯氨酸标准品于100mL容量瓶中,用水溶解,加1滴硫酸溶液(4.1),用水定容至刻度。3.7标准使用液：移取5.00mL标准储备液至500mL容量瓶中用水定容至刻度。分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、25.00mL、40.00mL、50.00mL于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,所得标准使用液浓度依次为0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.25μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL。临用现配。4仪器和设备4.1紫外分光光度计。4.2分析天平：感量1mg。DBS22/008—201224.3酸度计。4.4恒温干燥箱。4.5恒温水浴锅。5分析步骤5.1试样制备取液体乳样10.0g(乳粉1.0g加水至10.0g左右)至100mL具塞比色管或具塞三角烧瓶中,加入30mL硫酸溶液,盖上塞子,置于恒温干燥箱中,105℃水解6h。5.2过滤趁热将水解产物用滤纸过滤至250mL容量瓶中,用10mL硫酸溶液分3次洗涤比色管或三角烧瓶和滤纸,滤干后,用10mL水洗涤滤纸,合并上述溶液,用水定容至刻度,摇匀,所得溶液为水解液。5.3调pH值用移液管移取10mL水解液至100mL容量瓶中,加水50mL,用氢氧化钠溶液(4.5)将pH调至中性再用水定容至刻度,所得溶液为待测液。5.4测定5.4.1取4.0mL处理好的待测液于25mL比色管中,加入2.0mL氯胺T溶液,混匀后于室温下放置20min。取4.0mL水于25mL比色管中,与待测液同步实验,可得空白管。5.4.2加入2.0mL显色剂,充分混匀后,迅速将比色管放入60℃水浴中加热20min后取出比色管,用冰水浴冷却比色管3min,然后在室温下放置30min。用空白管做参比,在波长558nm处以紫外分光光度计测定其吸光度值。5.4.3标准曲线配制分别取4.0mL标准使用液,进行6.4.1至6.4.2的操作。以空白管做参比,以标准使用液的吸光度值为纵坐标,相对应的量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。6结果计算根据标准曲线查得该吸光度值对应的L-羟脯氨酸的量(μg),再通过公式计算样品中羟脯氨酸的含量。按式（1）计算10001000AmCX..................................(1)式中：X——试样中L-羟脯氨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——由标准曲线得到的试样溶液中L-羟脯氨酸的浓度，单位为微克（μg）；A——稀释倍数；m——称样量，单位为克（g）。7准确度和精密度DBS22/008—201237.1准确度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。在重现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7.2精密度本方法添加浓度为0.5mg～2.0mg时，加标回收率为87.2%～92.7%。第二法高效液相色谱法8原理试样经水解后，取上清液用丹磺酰氯在避光条件下衍生反应，生成具有荧光基团的稳定化合物，以乙腈和乙酸钠缓冲液为流动相，经C18色谱柱分离，荧光检测器（激发波长330nm，发射波长530nm）检测，外标法测定试样中L-羟脯氨酸的含量。9试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。9.1乙腈：色谱纯。9.2丹磺酰氯：色谱纯。9.3盐酸甲胺。9.4无水乙酸钠。9.5苯酚。9.6盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12mol/L）。9.7冰乙酸。9.8无水碳酸钠。9.9L-羟脯氨酸标准品，纯度为99%。9.10碳酸钠缓冲液（80mmol/L）：称取0.424g无水碳酸钠，加40mL水溶解，用1mol/L盐酸调pH值至9.5，用水定容至50mL。9.11蛋白水解剂：称取0.1g苯酚置于100mL容量瓶，加入50mL盐酸，用水定容至100mL。9.12丹磺酰氯溶液（1.5mg/mL）：称取0.15g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100mL。9.13盐酸甲胺溶液（20mg/mL）：称取2.0g盐酸甲胺，用水溶解并定容至100mL。9.14乙酸钠缓冲液（10mmol/L）：称取0.820g乙酸钠，加800mL水溶解，用冰乙酸调节pH值至4.8，用水定容至1000mL，经0.45µm微孔滤膜过滤。9.15L-羟脯氨酸标准储备液（1mg/mL）：准确称取50mgL-羟脯氨酸标准品，用水溶解并定容至50mL。9.16微孔滤膜：0.45µm，水相。10仪器与设备10.1高效液相色谱仪：配有荧光检测器。10.2酸度计。DBS22/008—2012410.3恒温干燥箱。10.4超声波振荡器。10.5涡旋混合器。10.6喷灯。11分析步骤11.1试样制备准确称取固体乳粉0.1g，液态乳0.5g于安瓿瓶中，加入3mL蛋白水解剂，充分混匀，用酒精喷灯封口,置于恒温干燥箱中,110℃水解24h。11.2样品衍生吸取1.00mL样液到10mL具塞玻璃试管中，加入1.00mL碳酸钠缓冲液（10.10），1.00mL丹磺酰氯溶液（10.12），充分混合，室温避光衍生反应90min-120min，加入0.10mL盐酸甲胺溶液（10.13）涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45µm微孔滤膜过滤，取滤液备用。衍生物在4℃可避光保存48h。11.3测定11.3.1参考色谱条件色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）或相当者。流动相：乙腈：乙酸钠（pH=4.8，10mmol/L）；流速：1.0mL/min。柱温：35℃。进样量：10μL。荧光检测波长：Ex=330nm，Em=530nm。梯度洗脱参考条件：见表1。表1（色谱分离）梯度洗脱条件时间（min）乙酸钠乙腈梯度变化曲线0.095%5%02.095%5%130.065%35%635.565%35%140.00%100%655.00%100%160.095%5%6注：流动相比例可根据情况适当调节。11.3.2标准曲线配制用水将L-羟脯氨酸标准储备液（10.15）分别稀释成1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL，按衍生样品的步骤（12.2）对标准品进行衍生反应，得到标准工作液。DBS22/008—20125将上述L-羟脯氨酸标准工作液依次进行色谱测定（其标准样品丹磺酰氯衍生物色谱图见附录A中图A.1），记录色谱峰高（或峰面积）。以峰高（或峰面积）为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线。11.3.3试样溶液的测定吸取试样待测液（12.2）10µL，将试样待测液进行色谱测定，从标准曲线中查得试液中L-羟脯氨酸的浓度。12结果计算试样中L-羟脯氨酸的含量X，以质量分数毫克每千克（mg/kg）表示，按（2）计算：10001000mVCX....................................(2)式中：X——试样溶液中L-羟脯氨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——试样溶液中L-羟脯氨酸的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V——试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；m——试样的质量，单位为克（g）；13准确度和精密度13.1准确度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。在重现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。13.2精密度本方法添加浓度为0.02mg～0.32mg时，加标回收率为89.5%～111.0%。第三法液相色谱-串联质谱法14原理试样经水解后，以乙腈和甲酸水溶液为流动相，经色谱柱分离，多离子反应方式（MRM）检测，外标法定量。应用子离子扫描方式对阳性样品进行定性确认。15试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。15.1乙腈：色谱纯。15.2甲酸：色谱纯。15.3苯酚。DBS22/008—2012615.4盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12mol/L）。15.5蛋白水解剂：称取0.1g苯酚置于100mL容量瓶，加入50mL盐酸，用水定容至100mL。15.6L-羟脯氨酸标准品，纯度为99%。15.7L-羟脯氨酸标准储备液（1mg/mL）：准确称取50mgL-羟脯氨酸标准品，用水溶解并定容至50mL。15.8L-羟脯氨酸标准中间液（10μg/mL）：用移液器精确吸取100µLL-羟脯氨酸标准储备液于10mL容量瓶，用水定容至刻度。16仪器与设备a）液相色谱-串联质谱联用仪。b）恒温干燥箱。c)超声波振荡器。d）涡旋混合器。e）喷灯。17分析步骤17.1试样制备准确称取固体乳粉0.1g，液态乳0.5g于安瓿瓶中，加入3mL蛋白水解剂，充分混匀，用酒精喷灯封口,置于恒温干燥箱中,110℃水解24h。17.2测定17.2.1参考色谱条件色谱柱：BEHT3（2.1mm×100mm，1.8μm）或相当者。流动相：水相：0.1%甲酸；有机相：乙腈。流速：0.3mL/min。柱温：35℃。进样量：5μL。梯度洗脱参考条件：见表2表2（色谱分离）梯度洗脱条件时间（min）水相有机相梯度变化曲线0.090%10%01.090%10%13.540%60%63.70%100%64.80%100%15.090%10%6注：流动相比例可根据情况适当调节。17.2.2检测离子参数选择见表3。DBS22/008—20127表3L-羟脯氨酸离子选择参数表化合物母离子定量子离子碰撞能量定性子离子碰撞能量离子化方式L-羟脯氨酸365.16170.152486.0414ESI+17.2.3标准曲线绘制用水将L-羟脯氨酸标准中间液（8.2.16）分别稀释成1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，进样得到标准曲线。（其标准样品多反应监测谱图见附录A中图A.2和图A.3）17.2.4试样溶液的测定吸取试样待测液（18.1）5µL，将试样待测液进行质谱测定，从标准曲线中查得试液中L-羟脯氨酸的浓度。要求被测试样中L-羟脯氨酸的保留时间与标准溶液中L-羟脯氨酸保留时间的相对偏差小于20%；样