GB 5413.37-2010 食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定

中华人民共和国国家标准GB5413.37—2010中华人民共和国卫生部发布2010-03-26发布2010-06-01实施食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定NationalfoodsafetystandardDeterminationofaflatoxinM1inmilkandmilkproductsGB5413.37—2010I前言本标准第一法对应于ISO14501：2007Milkandmilkpowder-determinationofaflatoxinM1content-clean-upbyimmunoaffinitychromatographyanddeterminationbyhigh-performanceliquidchromatography，本标准第一法与ISO14501：2007的一致性程度为非等效；本标准第二法和第三法代替GB/T18980-2003；本标准第四法来自于NY/T1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测双流向酶联免疫法》。本标准附录A和附录B为资料性附录。GB5413.37—20101食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定1范围本标准规定了乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定方法。标准第一法适用于乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定；第二法适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M1的测定；第三法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定；第四法适用于液态乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法免疫亲和层析净化液相色谱—串联质谱法3原理试样液体或固体试样提取液经均质、超声提取、离心，取上清液经免疫亲和柱净化，洗脱液经氮气吹干，定容，微孔滤膜过滤，经液相色谱分离，电喷雾离子源离子化，多反应离子监测（MRM）方式检测。基质加标外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲酸（HCOOH）。4.2乙腈(CH3CN)：色谱纯。4.3石油醚（CnH2n+2）：沸程为30℃～60℃。4.4三氯甲烷（CHCl3）。4.5氮气：纯度≥99.9%。4.6黄曲霉毒素M1标准样品：纯度≥98%。4.7乙腈-水溶液(1+4)：在400mL水中加入100mL乙腈。4.8乙腈-水溶液(1+9)：在450mL水中加入50mL乙腈。4.90.1%甲酸水溶液：吸取1mL甲酸（4.1），用水稀释至1000mL。4.10乙腈-甲醇溶液（50+50）：在500mL乙腈中加入500mL甲醇。4.11氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取2g氢氧化钠溶解于100mL水中。GB5413.37—201024.12空白基质溶液分别称取与待测样品基质相同的、不含所测黄曲霉毒素的阴性试样8份于100mL烧杯中。以下操作按6.1试液提取和6.2净化步骤进行。合并所得8份试样的纯化液，用0.22μm微孔滤膜的一次性滤头（5.23）过滤。弃去前0.5mL滤液，接取少量滤液供液相色谱－质谱联用仪检测。获得色谱－质谱图后，对照附录A中的图A.2，在相应的保留时间处，应不含黄曲霉毒素M1。剩余滤液转移至棕色瓶中，在-20℃电冰箱内保存，供配制标准系列溶液使用。4.13黄曲霉毒素M1标准储备溶液：分别称取标准品黄曲霉毒素M10.10mg（精确至0.01mg），用三氯甲烷（4.4）溶解定容至10mL。此标准溶液浓度为0.01mg/mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中后，在-20℃电冰箱内保存，备用。4.14黄曲霉毒素M1标准系列溶液：吸取黄曲霉毒素M1标准储备溶液（4.13）10µL于10mL容量瓶中，用氮气将三氯甲烷吹至近干，空白基质溶液（4.12）定容至刻度，所得浓度为10ng/mL的M1标准中间溶液。再用空白基质溶液（4.12）将黄曲霉毒素M1标准中间溶液稀释为0.5ng/mL、0.8ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、6.0ng/mL、8.0ng/mL的系列标准工作液。5仪器和设备5.1液相色谱-质谱联用仪，带电喷雾离子源。5.2色谱柱：ACQUITYUPLCHSST31，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.8μm，或同等性能的色谱柱。5.3天平：感量为0.001g和0.00001g。5.4匀浆器。5.5超声波清洗器。5.6离心机：转速≥6000转/分钟。5.750mL具塞PVC离心管。5.8水浴:温控30℃士2℃，50℃士2℃，温度范围25℃～60℃。5.9容量瓶:100mL。5.10玻璃烧杯:250mL，50mL。5.11带刻度的磨口玻璃试管:5mL，10mL，20mL。5.12移液管:1.0mL，2.0mL和50.0mL。5.13玻璃棒。5.1410目圆孔筛。5.15250mL分液漏斗。5.16100mL圆底烧瓶。5.17旋转蒸发仪。1给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GB5413.37—201035.18pH计：精度为0.01。5.19250mL具塞锥形瓶。5.20免疫亲和柱：针筒式3mL。5.2110mL和50mL一次性注射器。5.22固相萃取装置（带真空系统）。5.23一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜（水相系）。6分析步骤6.1试液提取6.1.1乳：称取50g(精确至0.01g)混匀的试样，置于50mL具塞离心管(5.7)中，在水浴(5.8)中加热到35℃～37℃。在6000转/分钟下离心15min。收集全部上清液，供净化用。6.1.2发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)：称取50g(精确至0.01g)混匀的试样，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液（4.11）在酸度计(5.18)指示下调pH至7.4，在9500转/分钟下匀浆(5.4)5min，以下按6.1.1进行操作。6.1.3乳粉和粉状婴幼儿配方食品：称取10g(精确至0.01g)试样，置于250mL烧杯中。将50mL已预热到50℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的水浴(5.8)中放置30min。溶解后冷却至20℃，移入100mL容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后分别移至两个50mL离心管(5.7)中，在6000转/分钟下离心15min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。6.1.4干酪：称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g(精确至0.01g)，置于50mL离心管(5.7)中，加2mL水和30mL甲醇，在9500转/分钟下匀浆5min，超声提取30min，在6000转/分钟下离心15min。收集上清液并移入250mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30mL石油醚（4.3），振摇2min，待分层后，将下层移于50mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2mL，浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4)（4.7）5mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50mL离心管中，加水稀释至约50mL，在6000转/分钟下离心5min，上清液供净化处理。6.1.5奶油：称取5g(精确至0.01g)试样，置于50mL烧杯中，用20mL石油醚(4.3)将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20mL水和30mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，将下层溶液全部移到100mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪（5.17）中减压浓缩至约5mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。6.2净化6.2.1免疫亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒与亲和柱(5.20)上顶部相串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接起来。注：根据免疫亲和柱的使用说明书要求，控制试液的pH值。6.2.2试样的纯化将以上6.1试液提取液移至50mL注射器筒(5.21)中，调节固相萃取装置的真空系统,控制试样以2mL/分钟～3mL/分钟稳定的流速过柱。取下50mL的注射器筒，装上10mL注射器筒。注射器筒内加入水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，在亲和柱下部放入10mL刻度试管，上部装上另一个10mL注射器筒，加入4mL乙腈(4.2),洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在刻度试管中(5.11)中，洗脱时间不少于60秒。然后用氮气缓缓地在30℃下将洗脱液蒸发至近干(如果蒸发至干，会损失黄曲霉毒素M1)，用乙腈-水溶液（1+9）稀释至1mL。GB5413.37—201046.3液相色谱参考条件流动相：A液，0.1%甲酸溶液；B液，乙腈-甲醇溶液（1+1）。梯度洗脱：参见附录A中的表A.1。流动相流动速度：0.3mL/min。柱温：35℃。试液温度：20℃。进样量：10µL。6.4质谱参考条件检测方式：多离子反应监测（MRM），详见表1中母离子、子离子和碰撞能量。扫描图参见附录A中的图A.1。表1离子选择参数表黄曲霉毒素母离子定量子离子碰撞能量定性子离子碰撞能量离子化方式M1329.0273.522259.522ESI+离子源控制条件：参见附录A中的表A.2。6.5定性试样中黄曲霉毒素M1色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。黄曲霉毒素M1的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％＞20％至50％＞10％至20％≤10％允许相对偏差±20%±25%±30%±50%各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。6.6试样测定按照6.3和6.4确立的条件，测定试液（6.2）和标准系列溶液（4.14）中黄曲霉毒素M1的离子强度，外标法定量。色谱图见附录A的图A.2。色谱参考保留时间：黄曲霉毒素M13.23min。6.7空白试验不称取试样，按6.5的步骤做空白实验。应确认不含有干扰被测组分的物质。6.8标准曲线绘制GB5413.37—20105将标准系列溶液（4.14）由低到高浓度进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。6.9定量测定待测样液中被测组分的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围时，则应将样液用空白基质溶液稀释后重新进样分析或减少取样量，重新按6.1进行处理后再进样分析。7分析结果的表述外标法定量，按式（1）计算黄曲霉毒素M1的残留量。mfVAX1×××=……………………………………………………（1）式中:X——试样中黄曲霉毒素M1的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；A——试样中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——样品定容体积，单位毫升（mL）；f——样液稀释因子；m——试样的称样量，单位克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法9原理亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当试样通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体—抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂