GBT 12388-1990 食物中维生素A和维生素E的测定方法

GB12388—1990中华人民共和国国家标准食物中维生素A和维生素E的测定方法MethodfordeterminationofretinolandtocopherolinfoodsGB/T12388—19901主题内容与适用范围本标准规定了用高效液相色谱法测定食物中维生素A和维生素E。本标准适用于食物中维生素A和维生素E的测定。第一篇高效液相色谱法2原理样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C2n反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。最小检出量分别为VA：0.8ng，α-B：91.8ng：γ-E：36.6ng：δ-E：20.6ng。3试剂实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。3．1无水乙醚：不含有过氧化物。3．1．1过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该醚需处理后使用。3．1．2去除过氧化物的方法：熏蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃去10%蒸馏水和10%残留液。3．2无水乙醇：不得含有醛类物质。3．2．1检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醛，摇刀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。3．2．2脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。3．3无水硫酸钠。3．4甲醇：重蒸后使用。3．5重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。3．610%抗坏血酸溶液（m/V）：临用前配制。3．71：1氢氧化钾溶液。3．810%氢氧化钠溶液（m/V）。3．95%硝酸银溶液（m/V）。中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施GB12388—19903．10银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。3．11维生素A标准液：视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（纯度90%）经皂化处理后使用，用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。3．12维生素E标准液：α-生育酚（纯度95%），γ-生育酚（纯度95%），δ-生育酚（纯度95%）。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。3．13内标溶液：称取苯并[α]芘[纯度98%]，用脱醛乙醇配制成每1mL相当于10μg苯并[e]芘的内标溶液。3．14pH1～14试纸。4仪器和设备4．1实验室常用设备。4．2高压液相色谱仪带紫外分光检测器。4．3旋转蒸发器。4．4高速离心机4．4．1小离心管：具塑料盖1.5～3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）。4．5高纯氮气。4．6恒温水浴锅。4．7紫外分光光度计。5操作步骤5．1样品处理5．1．1皂化称取1～10g样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均刀为止。加5mL10%抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混刀。加10mL1：1氢氧化钾，混刀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。5．1．2提取5．1．2．1将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣。可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。5．1．3洗涤5．1．3．1用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。5．1．4浓缩5．1．4．1将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套250～300mL球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于65℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。5．1．5带乙醇液移入一小塑料离心管中（4.4.1），离心5min（5000rpm）。上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施GB12388—1990再用乙醇重新定容。并记下体积比。5．2标准曲线的制备5．2．1维生素A和维生素E标准浓度的标定方法取维生素A和各维生素E标准若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定被长测定各维生素的吸光值，用比吸光系数计算出该维生素的浓度。测定条件如下表所示。表1标准加入标准的量S，μL比吸光系数%1cmE波长λ，nm视黄醇γ-生育酚δ-生育酚α-生育酚10.00100.00100.00100.0018357192.891.2325294298298浓度计算：311000.31001−×××=SEAX…………………………………………（1）式中：X1——其维生素浓度，g/mL；A——维生素的平均紫外吸光值；S——加入标准的量，μL；E——某种维生素1%比吸光系数；31000.3−×S——标准液稀释倍数。5．2．2标准曲线的制备本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、γ-生育酚、α-生育酚、δ-生育酚及内标苯并[e]芘液混合均刀。选择合适灵敏度；使上述物质的各峰高约为江量程70%，为高浓度点。高浓度的21为低浓度点（其内标苯并[e]芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图，维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施GB12388—1990维生素A和维生素E色谱图本方法不能将β-E和γ-E分开，故γ-E峰中包含有β-E峰。5．3高效液相色谱分析5．3．1色谱条件（推荐条件）5．3．1．1预柱：nltrasphereODSloum，4mm×4.5cm。5．3．1．2分析柱：nltrasphereODSsum，4.5mm×25cm。5．3．1．3流动相：甲醇：水=98：2。混刀，于临用前脱气。5．3．1．4紫外检测器波长：300nm。量程0.02。5．3．1．5进样量：20μL。5．3．1．6流速：1.7mL/min。5．4样品分析取样品浓缩液20μL，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。5．4．1定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。5．4．2定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查测其含量。或用回归方程求出其含量。6计算10001002××=VmcX……………………………………………………（2）式中：X2——某种维生素的含量，mg/100g；c——由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL；V——样品浓缩定容体积，mL；m——样品质量，g。用微处理机二点内标法进行计算时，按其计算公式计算或由微机直接给出结果。7结果的允许差同一实验室，同时测定或重复测定结果相对偏差绝对值＜10%。第二篇比色法8原理中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施GB12388—1990维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。9试剂本实验用水均为蒸馏水。9．1无水硫酸钠：同3.3。9．2乙酸酐。9．3乙醚：同3.1。9．4无水乙醇：同3.2。9．5三氯甲烷：应不含分解物，否则会破坏维生素A。9．5．1检查方法三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。9．5．2处理方法试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏。9．625%三氯化锑-三氯甲烷溶液，用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意勿使吸收水分）。9．71：1氢氧化钾溶液。9．8维生素A或视黄醇乙酸酯标准液：同3.11。其标定方法同5.2.1。9．9酚酞指示剂：用95%乙醇配制1%溶液。10仪器和设备10．1实验室常用设备。10．2分光光度计。10．3回流冷凝装置。11操作步骤维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。11．1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。11．1．1皂化法：适用于维生素A含量不高的样品。可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。11．1．1．1皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5～5g样品于三角瓶中。加入10mL1：1氢氧化钾及20～40mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。11．1．1．2提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。11．1．1．3洗涤：用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15～20mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施GB12388—1990液与酚酞指示剂呈无色为止（大约3次）。醚层液静置10～20min，小心放出析出的水。11．1．1．4浓缩：将层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置冰浴上蒸馏，收回乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。11．1．2研磨法：适用于每克样品维生素A含量大于5～10µg样品的测定，如肝的分析。步骤简单，省时，结果准确。11．1．2．1研磨：精确称2～5g样品，放入盛有3～5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。11．1．2．2提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50～100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需1～2h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时需在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中）。11．1．2．3浓缩：取澄清提取乙醚液2～5mL，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。12测定步骤12．1标准曲线的制备准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。12．2样品