酵母双杂交实验 教案

酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）一、实验目的掌握酵母双杂交原理和方法。二、实验原理酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNAbindingdomain,DB）和转录激活结构域（activationdomain,AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性，将BD与已知的诱饵蛋白质X融合，构建出BD-X质粒载体；将AD基因与cDNA文库，基因片段或基因突变体（以Y表）融合，构建AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。蛋白质X和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或LacZ）等的表达，使转化体由于HIS3或LEU2表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ表达而在X-Gal存在下显蓝色。图1-1酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。(2)用已知功能的蛋白做诱饵，在cDNA文库中寻找有相互作用的未知蛋白，以获取蛋白质相互作用的网络途径信息。(3)以功能未知的新蛋白去筛选文库，根据选到的靶蛋白的已知功能来推测该新蛋白的功能。(4)建立蛋白质相互作用的图谱。使用酵母双杂交系统应注意如下问题：(1)在筛选文库之前，要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因。(2)由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky）。一般情况下，在培养基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达。(3)在完成筛选之后，需检测猎物蛋白是否自激活。一个完整的利用酵母双杂交筛选相互作用蛋白的实验包括cDNA文库的构建，诱饵基因载体构建，载体转化酵母，报告基因渗漏表达滴定，酵母接合实验，报告基因表型的测定，诱饵蛋白与靶蛋白相互作用复验。本实验只完成酵母接合实验，报告基因表型的测定。在本实验中，pDEST32质粒携带诱饵蛋白MED25，营养标记基因是Leu2，转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）AH109（Mata，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4△，gal80△，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2，URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ，MEL1）菌株中；pDEST22质粒携带的靶蛋白文库来自拟南芥转录因子，营养标记基因是Trp1，转化到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y187（MATαura3-52,his3-200,ade2-101,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,met–,gal80Δ,MEL1,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ）菌株中。报告基因使用HIS3。诱饵载体和猎物载体的启动子都是酵母组成型强启动子ADH。其中，拟南芥转录因子库是组分特异的库（specificlibraries），相对传统全cDNA库而言，它不受组分的组织表达特异性、发育阶段特异性以及表达量低的影响，提高了筛选效率。该库由1000多个独立的克隆组成，筛选后不需测序。图1-2实验材料示意三、材料、试剂、仪器1.材料酵母菌株AH109含有pDEST32-bait质粒(Leu)酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22-prey质粒(Trp)，共有4个不同基因酵母菌株Y187（Matα）含有pDEST22空质粒(Trp)2.试剂液体YPAD培养基30ml液体SD-Trp培养基30ml液体SD-Leu培养基5ml固体SD-Trp-Leu培养基30ml固体体SD-Trp-Leu-His培养基30ml灭菌水30ml如上培养基需121℃灭菌15分钟。3.仪器30℃的恒温摇床，30℃的恒温培养箱，电子天平，pH计；量筒（10ml，100ml），烧杯（50ml，100ml），玻璃棒，1000ul移液器,200ul移液器,20ul移液器。灭菌的1000ul、200ul吸头，灭菌的10ml试管，灭菌的1.5ml离心管，灭菌平皿。四、操作1.实验准备灭菌：各种培养基，蒸馏水约30ml，10ml试管约10支，1.5ml离心管约20个，200ul和1000ul吸头各半盒。2.培养酵母1)挑酵母诱饵蛋白单菌落，以3mlSD-Trp培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。2)选含AD蛋白单菌落，分别以3mlSD-Leu培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。3)挑酵母AD阴性对照单菌落，以3mlSD-Trp培养基培养过夜。培养条件：30℃，200rpm。3.酵母接合在4个新试管中分别加入2.8mlYPAD培养基，各加100ul诱饵蛋白的菌液，再分别加入100ul各靶蛋白及对照的菌液，混匀，30℃，200rpm培养16-24小时。4.在筛选培养基上培养接合后的酵母取酵母菌液，用灭菌水稀释到1/10，点到筛选培养基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade平板上，每个点5ul。5.观察实验结果2-4观察实验结果五、实验提示1.如果诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能激活报告基因，可以用什么方法继续寻找与之相互作用的蛋白？