HJ 1069-2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法

中华人民共和国国家环境保护标准HJ1069-2019水质急性毒性的测定斑马鱼卵法Waterquality—Determinationoftheacutetoxicity—Zebrafish(Daniorerio)eggsmethod（发布稿）本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2019-12-31发布2020-06-30实施生态环境部发布i目次前言.............................................................................................................................................ⅱ1适用范围.....................................................................................................................................12规范性引用文件.........................................................................................................................13术语和定义.................................................................................................................................14方法原理.....................................................................................................................................25干扰和消除.................................................................................................................................26试剂和材料.................................................................................................................................27仪器和设备.................................................................................................................................38样品.............................................................................................................................................49试验步骤.....................................................................................................................................510结果计算与表示.......................................................................................................................711有效性、敏感性与精密度.......................................................................................................712质量保证和质量控制...............................................................................................................813试验报告...................................................................................................................................814废弃物处置...............................................................................................................................8附录A（资料性附录）斑马鱼卵相关发育阶段.......................................................................9附录B（资料性附录）斑马鱼种鱼驯养及维持.....................................................................10附录C（资料性附录）产卵盒参考图片.................................................................................11附录D（资料性附录）斑马鱼卵鉴别.....................................................................................12附录E（资料性附录）24孔细胞培养板试验布局设置方案.................................................15附录F（资料性附录）推荐的数据记录表..............................................................................16附录G（资料性附录）寇式法计算EC50................................................................................18ii前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法。本标准的附录A～附录G为资料性附录。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。本标准验证单位：中国环境科学研究院环境分析测试技术中心、中国环境监测总站、生态环境部南京环境科学研究所、浙江省环境监测中心、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所和江苏国创环保科技有限公司。本标准生态环境部2019年12月31日批准。本标准自2020年6月30日起实施。本标准由生态环境部解释。1水质急性毒性的测定斑马鱼卵法1适用范围本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。2规范性引用文件本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。GB/T6920水质pH值的测定玻璃电极法GB/T13267水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法HJ91.1污水监测技术规范HJ506水质溶解氧的测定电化学探头法HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1鱼卵fishegg指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录A。3.2稀释倍数dilutionlevel原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用D来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数D=1；取250ml水样稀释至1000ml（即体积分数为25%），则稀释倍数D=4。3.3最低无效应稀释倍数lowestineffectivedilution测试中不产生测试效应的最低稀释倍数，本标准指不少于90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数，用LID表示。3.4半数效应浓度EC50指暴露48h后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用EC50表示。本标准中EC50即半数致死浓度LC50。23.5参比物质referencesubstance测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中3,4-二氯苯胺。4方法原理使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将4-细胞期～128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在26℃±1℃的条件下培养48h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算LID或EC50值，表征水样的急性毒性。5干扰和消除水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8）中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。6试剂和材料6.1受试生物6.1.1种鱼使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长3.5cm左右，鱼龄在6月～24月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前6个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录B。6.1.2鱼卵确保试验鱼卵受精率≥70%，处于4-细胞期～128-细胞期（见附录A）。6.2试剂除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满足pH值6.5～8.5，电导率＜10μS/cm的要求。6.2.1氢氧化钠（NaOH）。6.2.2氯化钙（CaCl2·2H2O）。6.2.3硫酸镁（MgSO4·7H2O）。6.2.4碳酸氢钠(NaHCO3)。6.2.5氯化钾（KCl）。6.2.63,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），优级纯。6.2.7盐酸：ρ（HCl）=1.19g/ml。36.2.8盐酸溶液：c（HCl）=0.1mol/L。量取8.3ml盐酸（6.2.7），用水定容至1000ml。6.2.9氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1mol/L。称取4g氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至1000ml。6.2.10参比物质3,4-二氯苯胺储备液：ρ（C6H5Cl2N）=100mg/L。称取0.05g3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定容至500ml，静置24h，调节pH值至7.0。避光冷藏保存，储备液可储存6个月。6.2.11参比物质3,4-二氯苯胺工作液：ρ（C6H5Cl2N）=3.7mg/L。量取3.7ml参比物质3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水（6.2.16）定容至100ml，使用前按8.2.1步骤平衡至26℃±1℃。该溶液作为阳性对照，临用前现配。6.2.12氯化钙储备液：ρ（CaCl2·2H2O）=11.76g/L。称取11.76g氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可储存