SNT 2651-2010 肉及肉制品中常见致病菌检测方法 基因芯片法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６５１—２０１０肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊—犌犲狀犲犮犺犻狆犿犲狋犺狅犱２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心。本标准主要起草人：肖进文、李应国、刘生峰、王昱、聂福平、谭志、周庆、张亮、臧庆伟。Ⅰ犛犖／犜２６５１—２０１０肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法１　范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的基因芯片检测方法。本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ１７的基因芯片检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检验ＳＮ０１７０　出口食品中沙门氏菌（包括亚利桑那菌）检验方法ＳＮ０１７２　出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法ＳＮ０１７５　出口食品中弯曲杆菌检验方法ＳＮ／Ｔ０１８４．１　出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法ＳＮ／Ｔ０９７３　进出口肉、肉制品以及其他食品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检验方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１基因芯片　犇犖犃犮犺犻狆核酸检测探针按照有序的行列格式点制在固相支持物上，通过特定温度下与相应样品进行杂交而用于样品中核酸种类定性分析的一种高通量技术。４　生物安全要求４．１　环境要求实验室的安全防护按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。４．２　废弃物处理和防止污染措施检测过程中的废弃物需经１２１℃高压灭菌处理至少３０ｍｉｎ后再弃置。检测过程中防止交叉污染的措施按照标准ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定执行。１犛犖／犜２６５１—２０１０５　方法概述针对５种目标菌保守基因片段设计引物，提取待检样品增菌液的ＤＮＡ为模板进行两个独立的多重ＰＣＲ扩增。扩增产物与固定有５种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。阳性结果用传统方法确证。６　设备和材料６．１　高压灭菌锅。６．２　恒温培养箱。６．３　微需氧培养装置。６．４　高速离心机（２００００犵以上）。６．５　水浴锅（３７℃、４２℃、７０℃）。６．６　ＰＣＲ超净工作台。６．７　ＰＣＲ仪。６．８　水平式电泳仪。６．９　凝胶成像分析系统。６．１０　水浴摇床６．１１　基因芯片扫描仪。６．１２　基因芯片清洗仪（可选）。６．１３　芯片杂交盒。６．１４　微量可调移液器和灭菌吸头：２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。６．１５　灭菌ＰＣＲ反应管。７　培养基和试剂７．１　缓冲胨水增菌液（ＢＰ）（见附录Ａ．１）。７．２　四硫磺酸盐煌绿增菌液（ＴＴＢ）（见附录Ａ．２）。７．３　改良缓冲蛋白胨水（ＭＢＰ）（见附录Ａ．３）。７．４　增菌培养液（ＥＢ）（见附录Ａ．４）。７．５　１０％氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤（见附录Ａ．５）。７．６　弯曲杆菌增菌肉汤（见附录Ａ．６）。７．７　改良Ｅ．Ｃ新生霉素增菌肉汤［ｍ（ＥＣ）ｎ］（见附录Ａ．７）。７．８　电泳级琼脂糖７．９　晶芯?食源性致病微生物检测芯片试剂盒１）７．９．１　ＰＣＲ引物序列（参见附录Ｂ）。７．９．２　芯片探针序列（参见附录Ｂ）。７．９．３　缓冲液ＧＡ：２５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和５％ＳＤＳ，ｐＨ８．０。７．９．４　缓冲液ＧＢ：５ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸胍。１）　该试剂盒是博奥生物有限公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。２犛犖／犜２６５１—２０１０７．９．５　去蛋白液ＧＤ：３ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸胍。７．９．６　漂洗液ＰＷ：２ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液，ｐＨ７．５。７．９．７　蛋白酶Ｋ。７．９．８　吸附柱ＣＢ３和收集管。７．９．９　ＲｎａｓｅＡ溶液。７．９．１０　洗脱缓冲液ＴＥ：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ缓冲液，ｐＨ８．０。７．９．１１　ＰＣＲＭｉｘⅠ（组成参见附录Ｃ）。７．９．１２　ＰＣＲＭｉｘⅡ（组成参见附录Ｃ）。７．９．１３　犜犪狇酶（５Ｕ／μＬ）。７．９．１４　ＰＣＲ阳性质控基因组ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）。７．９．１５　ＧｏｌｄＶｉｅｗ（ＧＶ）。７．９．１６　２×ＰＣＲ载样液。７．９．１７　ＤＮＡ分子量标记２０００。７．９．１８　洗涤液Ⅰ：２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ（参见附录Ｃ）。７．９．１９　洗涤液Ⅱ：０．２×ＳＳＣ（参见附录Ｃ）。７．９．２０　检测芯片。８　检测程序检测流程见图１。图１　基因芯片法检测肉及肉制品中致病菌流程图３犛犖／犜２６５１—２０１０９　操作步骤９．１　增菌９．１．１　沙门氏菌增菌按ＳＮ０１７０要求，对样品进行增菌培养。９．１．２　单核细胞增生李斯特氏菌增菌按ＳＮ／Ｔ０１８４．１要求，对样品进行增菌培养。９．１．３　金黄色葡萄球菌增菌按ＳＮ０１７２要求，对样品进行增菌培养。９．１．４　空肠弯曲杆菌增菌按ＳＮ０１７５要求，对样品进行增菌培养。９．１．５　大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７增菌按ＳＮ／Ｔ０９７３要求，对样品进行增菌培养。９．２　细菌基因组犇犖犃提取９．２．１　取上述５种增菌培养液各１ｍＬ至一个１０ｍＬ无菌离心管中混匀，从中取１ｍＬ至一个１．５ｍＬ无菌离心管中，２５００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ。取上清液８００μＬ到另一新的离心管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。弃掉上清液，沉淀中加入１８０μＬ缓冲液ＧＡ，振荡至菌体彻底悬浮。３７℃作用１ｈ～３ｈ。加入２０μＬＲｎａｓｅＡ溶液，振荡１５ｓ，室温放置５ｍｉｎ。注：余下的混合增菌液应放入冰箱，以备后期芯片检测阳性样品的确证实验用。９．２．２　向管中加入２０μＬ蛋白酶Ｋ溶液，混匀后加入２２０μＬ缓冲液ＧＢ，振荡１５ｓ，７０℃放置２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。简短离心以去除管盖内壁的水珠。９．２．３　加２２０μＬ无水乙醇，充分振荡混匀１５ｓ。简短离心以去除管盖内壁的水珠。将全部液体转移到吸附柱中。９．２．４　向吸附柱中加入５００μＬ去蛋白液ＧＤ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。９．２．５　向吸附柱中加入７００μＬ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ。倒掉废液，吸附柱放入收集管中。９．２．６　向吸附柱加入５００μＬ漂洗液ＰＷ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，倒掉废液。９．２．７　吸附柱放回收集管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，去除吸附柱中残余的漂洗液。将吸附柱置于室温或５０℃温箱放置２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。９．２．８　将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加５０μＬ经６５℃～７０℃水浴预热的洗脱缓冲液ＴＥ，室温放置２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ。９．２．９　再次向吸附膜的中间部位悬空滴加５０μＬ经６５℃～７０℃水浴预热的洗脱缓冲液ＴＥ，室温放置２ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。回收得到的ＤＮＡ产物于－２０℃冰箱保存备用。９．２．１０　ＤＮＡ结果检测。用０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ提取物。细菌基因组ＤＮＡ通过琼脂糖凝胶电泳，出现的电泳条带位置在１００００ｂｐ以上，且清晰可见。９．３　犘犆犚扩增９．３．１　将提取的细菌基因组ＤＮＡ同时用两个ＰＣＲ反应体系进行扩增，电泳检测ＰＣＲ扩增产物。９．３．２　ＰＣＲ反应体系Ⅰ的配制如表１。表１　犘犆犚反应体系Ⅰ单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控ＭｉｘⅠ８．６８．６８．６犜犪狇（５Ｕ／μＬ）０．２０．２０．２细菌基因组ＤＮＡ２——４犛犖／犜２６５１—２０１０表１（续）单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控阳性质控基因组ＤＮＡ—２—无核酸酶灭菌水９．２９．２１１．２９．３．３　ＰＣＲ反应体系Ⅱ的配制如表２。表２　犘犆犚反应体系Ⅱ单位为微升反应液组成检测反应阳性质控阴性质控ＭｉｘⅡ７．４７．４７．４犜犪狇（５Ｕ／μＬ）０．２０．２０．２细菌基因组ＤＮＡ２——阳性质控基因组ＤＮＡ—２—无核酸酶灭菌水１０．４１０．４１２．４９．３．４　ＰＣＲ反应的循环参数：９４℃预变性５ｍｉｎ；进入循环，９４℃／３０ｓ、５６℃／３０ｓ、７２℃／１ｍｉｎ４０ｓ，共４０个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。９．３．５　ＰＣＲ扩增结果检测：ＰＣＲ反应结束后取３μＬ扩增产物加入３μＬ２×ＰＣＲ载样液，用１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。若在１０００ｂｐ～１５００ｂｐ之间出现明显的扩增条带，即可进行芯片杂交实验。注：如果在此片段范围内无可见扩增条带，同时阳性质控也无可见扩增条带，则可能为扩增失败，建议更换另一批次的ＰＣＲ扩增试剂，重新扩增。９．４　芯片杂交９．４．１　杂交体系配制：将杂交液置４２℃水浴预热５ｍｉｎ，按表３配制。表３　杂交体系组　　分体积／μＬ杂交液８２种ＰＣＲ扩增产物各３．５总体积１５９．４．２　变性：将杂交体系９５℃变性５ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ。９．４．３　杂交：将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒的两边凹槽内加入约８０μＬ灭菌水，将固定有探针片段的芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上；揭掉芯片盖片的塑料薄膜，放在芯片的黑色围栏上，凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入１５μＬ变性后的杂交液。不要振动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖，放入４２℃恒温水浴中，静置，杂交２ｈ以上。９．４．４　芯片洗涤：ａ）　手动清洗：按需要量配制好芯片洗液Ⅰ和涤液Ⅱ，并在４２℃预热３０ｍｉｎ。取出杂交后芯片，将芯片放在预热好的洗液Ⅰ中，４２℃水浴摇床振荡清洗４ｍｉｎ，再转入预热好的洗液Ⅱ中，４２℃５犛犖／犜２６５１—２０１０水浴摇床振荡清洗４ｍｉｎ。最后用４２℃预热好清水中振荡清洗一次，清洗后的芯片经１５００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ以去除芯片表面的液体。此芯片可避光保存，在４ｈ内扫描结果；ｂ）　芯片清洗仪清洗：按需要量配制好芯片洗液Ⅰ和洗液Ⅱ。按仪器操作说明书要求将芯片清洗仪开机预热，待预热完成后将芯片放入清洗槽中开始清洗，清洗完成后，将芯片放入清洗仪器的离心腔中离心甩干。９．５　芯片扫描及结果判读９．５．１　芯片杂交结果扫描：使用微阵列芯片扫描仪对洗净杂交后的芯片进行扫描分析。９．５．２　结果的判定标准：ａ）　信号值≥背景信号平均值＋４×背景信号值标准差，且信号值≥阴性对照信号平均值＋４×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阳性；ｂ）　背景信号平均值＋２×背景信号值标准差＜信号值＜背景信号平均值＋４×背景信号值标准差，且阴性对照信号平均值＋２×阴性对照信号值标准差＜信号值＜阴性对照信号平均值＋４×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为疑似；ｃ）　信号值≤背景信号平均值＋２×背景信号值标准差，且信号值≤阴性对照信号平均值＋２×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阴性。１０　结果报告若芯片检测结果为阴性，则结果报告为相应的微生物阴性；若检测结果为阳性或者疑似，则分别按照下列标准进行进一步确证：———ＳＮ０１７０；———ＳＮ／Ｔ０１８４．１；———ＳＮ０１７２；———ＳＮ０１７５；———ＳＮ／Ｔ０９７３。６犛犖／犜２６５１—２０１０附　录　犃（规范性附录）培养基的配制犃．１　缓冲胨水增菌液（犅犘）蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钠（含１２个结晶水）９．０ｇ磷酸二氢钾１．５ｇ蒸馏水１０００．０ｍＬ将各成分加入蒸馏水中，搅