SZDBZ 132-2015 小反刍兽疫抗体检测 竞争酶联免疫吸附法

SZDB/Z132-20151深圳市标准化指导性技术文件SZDB/ZSZDB/Z132-2015小反刍兽疫抗体检测竞争酶联免疫吸附法DetectionMethodofCompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassayforPestedespetitsruminants2015-02-27发布2015-03-01实施发布深圳市市场监督管理局ICS11.220B41SZDB/Z132-2015I目次前言..............................................................................................................................................................II1范围................................................................................................................................................................12规范性引用文件............................................................................................................................................13原理................................................................................................................................................................14缩略语............................................................................................................................................................15试剂和材料....................................................................................................................................................26主要器械和设备............................................................................................................................................27PPRV重组N蛋白抗原的制备....................................................................................................................38PPRV单克隆抗体的制备.............................................................................................................................49待测样品的采集和处理................................................................................................................................510竞争酶联免疫吸附（C-ELISA）试验.......................................................................................................6附录A.................................................................................................................................................................8SZDB/Z132-2015II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为规范性附录。本标准由深圳市检验检疫科学研究院提出。本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心。本标准主要起草人：阮周曦、曾少灵、唐金明、花群义、吕建强、杨俊兴、曹琛福、卢体康、廖立珊、陈兵、孙洁、叶奕优、黄超华、马春伟、陈淼、程思。SZDB/Z132-20151小反刍兽疫抗体检测竞争酶联免疫吸附法1范围本标准规定了检测小反刍兽疫抗体检测竞争酶联免疫吸附法及其试剂制备方法。本标准适用于小反刍兽疫抗体检测、监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范《中国兽药典》第三部附录3原理酶联免疫吸附试验是由酶分子与抗体分子共价结合形成酶标记抗体，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合，当加入底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，从而出现显色反应，此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定，从而通过底物的显色反应来判定有无相应的免疫反应。本标准竞争酶联免疫吸附试验则是在ELISA板上包被小反刍兽疫病毒重组N蛋白的制备特异性抗原，然后加入待检血清和抗小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体，如果待检血清中存在小反刍兽疫病毒N蛋白抗体，就会竞争性地与包被抗原发生反应。如果待检血清中抗体越多，则特异性单克隆抗体与包被抗原结合的就相对少，从而最终的显色反应就浅。因待检血清中抗体的含量与颜色呈反比，所以可通过显色反应酶标仪读数的方式判定待检血清中是否有小反刍兽疫病毒抗体。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PPR：小反刍兽疫。PPRV：小反刍兽疫病毒。C-ELISA：竞争酶联免疫吸附试验。SZDB/Z132-20152PPRV-N蛋白：小反刍兽疫病毒核蛋白。AcNPV：苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒。sf9细胞：草地夜蛾卵巢细胞。pfu：蚀斑形成单位。r/min：转速单位，转/分。IMDM：伊思柯夫改良培养液。SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。PI：抑制百分率。5试剂和材料a)包被抗原：PPRV重组N蛋白表达抗原。b)单克隆抗体：抗PPRV-N蛋白特异性单克隆抗体。c)实验动物：10周龄左右SPF级BALB/c雌鼠。d)标准血清：小反刍兽疫标准阳性血清、弱阳性血清、阴性血清，由世界动物卫生组织（OIE）参考实验室或中国农业部指定实验室提供。e)待测血清：动物血清56℃灭能30min。f)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（HRP标记的羊抗鼠IgG）：按说明书指定的工作浓度稀释使用。g)包被液、洗涤液、稀释液、底物液/显色剂、终止液：配制方法见附录A。h)水：符合GB/T6682分析实验室二级水规格。i)可拆96孔酶标板。6主要器械和设备恒温摇床；真空冻干机；台式高速离心机；凝胶成像系统；CO2恒温箱；多波段酶标仪；洗板机；SZDB/Z132-20153超声波破碎仪；单孔道、多孔道可调微量移液器（1L、50L、100L、1000L）、微量滴头；紫外分光光度计。7PPRV重组N蛋白抗原的制备7.1种毒为携重组昆虫杆状病毒AcNPV-PPRV-N株，为携带小反刍兽疫病毒N基因的pFastHTA-PPRV-N重组质粒转座DH10Bac，提取杆粒转染sf9昆虫细胞获得。由深圳市检验检疫科学研究院构建、鉴定、保管和供应。7.2种毒含量测定7.2.1用含10%胎牛血清的Grace's培养基重悬sf9昆虫细胞，调整细胞浓度为5×105个细胞/mL，加入6孔板，每孔2mL细胞悬液，置CO2恒温培养箱27℃培养24h，用Grace's培养基洗涤细胞2次。7.2.2取种毒病毒液，用Grace's培养基由10-1开始作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8病毒液体，各加两孔，每孔1mL，做好标记。培养2h后收取菌液。7.2.36孔培养板置27℃孵育1h，吸取培养板中病毒液弃去，加入40℃水浴的含4%琼脂糖、20%胎牛血清的2xGrace's培养基，置CO2恒温培养箱27℃培养7d～10d，观察并进行蚀斑计数。7.2.4按照病毒滴度=蚀斑数×病毒稀释倍数/每孔体积数mL进行计算；病毒含量应≥1.0×106pfu/mL。7.3病毒繁殖和培养7.3.1将保存的昆虫杆状病毒AcNPV-PPRV-N株种毒，按1∶10比例接种于长成单层的sf9昆虫细胞，在2%胎牛血清的Grace's培养基中27℃培养72～96h，待出现80%细胞病变，收获病毒液作为生产用种子病毒。7.3.2取生产用种毒按1∶10接种于长成单层的sf9昆虫细胞，扩大培养，27℃下培养96～120h后，出现80%细胞病变，收获细胞悬液。7.4PPR-N蛋白抗原的纯化7.4.1取收获细胞悬液，置－80℃冰箱，反复冻融3次，以25KHz超声波破碎50次，每次20s，间隔30s，8000r/min离心30min，收获上清液。SZDB/Z132-201547.4.2在35000r/min超速离心120min，按超速离心前体积的1/100，用灭菌pH7.2的PBS溶解沉淀蛋白，加入硫柳汞至终浓度为0.01%，按0.5g/mL加入leupeptin（亮抑酶肽）蛋白酶抑制剂，按0.5mL/管分装，真空冻干保存。7.5PPRV重组N蛋白抗原的检验及贮藏7.5.1性状PPRV重组N蛋白抗原应为白色固体，无臭、无味。7.5.2浓度测定每瓶用PBS复溶为0.5mL液体。用紫外分光光度计测定在OD280和OD260波长下的光吸收值，按公式1.45×OD280-0.74×OD260计算抗原浓度，蛋白质浓度应不低于400g/mL。7.5.3效价测定每瓶PPRV重组N蛋白抗原用去离子水复溶为0.5mL液体后，用pH9.6的碳酸盐缓冲液1∶100稀释后包被酶标板，每孔100L，37℃作用1h，洗板3次，加入小反刍兽疫单克隆抗体（约1.7ng/孔），37℃作用1h，洗板3次，加入1∶5000稀释的H辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃作用1h。洗板3次，加入底物溶液避光显色10～15min，用1mol/LH2SO4终止反应，用酶标仪读数OD450值大于或等于1.0。7.5.4特异性检验与5份小反刍兽疫病毒阳性血清进行酶联免疫吸附试验时，应呈阳性反应；与小反刍兽疫病毒阴性血清、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、羊痘病毒阳性血清各1份进行酶联免疫吸附试验时，应呈阴性反应。7.5.5纯净检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体污染。7.5.6贮藏与有效期真空冻干抗原于2～8℃保存，有效期为12个月。8PPRV单克隆抗体的制备8.1杂交瘤细胞系分泌抗小反刍兽疫病毒核蛋白的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，由深圳市