DB3701／T102-2007 玉米种子产地检疫技术规程

ICSB31济南市农业地方规范DB3701DB3701/T102-2007玉米种子产地检疫技术规程2007-08-29发布2007-08-29实施济南市质量技术监督局发布DB3701/T102-2007前言本规范由济南伟丽种业有限公司提出。本规范由济南市农业局负责起草。本规范主要起草人：袁瑞农、王守宽、赵克思、张振成、张健、刘红娟。DB3701/T102-20073玉米种子产地检疫操作规程1适用范围本规程规定了玉米种子产地检疫操作规程。本规程适用于繁育玉米良种的科研、教学、生产单位繁育玉米种子。2规范性引用文件下列标准的条文通过在本规范中的引用而成为本规范的条文。凡是注日期的文件，其随后所有的修改单（不包括勘误表的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新标准适用于本规范。GB4404.1-1996粮食作物种子禾谷类GB15569-1995农业植物调运检疫操作规程。3术语和定义3.1产地检疫指健康种子生产过程中的全部检疫工作,包括选地、选种和田间、室内检验及签证。3.2检疫性有害生物对受其威胁的地区具有潜在经济重要性、但尚未在该地区发生，或虽已发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。[粮农组织，1990年；1995年修改；国际植物保护公约，1997年]4检疫性有害生物：4.1玉米霜霉病菌（Peronosclerosporaspp.）4.2玉米细菌性枯萎病菌Pantoeastewartiisubsp.stewartiiMergaertetal.4.3玉米干腐病菌Diplodiazeae(Schw.)Lev.4.4玉米高氏细菌性萎焉病菌Clavibactormichiganensissubsp.nebraskensisDavisetal.5选地及报检5.1选地生产单位要有计划的建立相对稳定的玉米种子繁育基地。繁育基地应选择在无检疫性有害生物分布的地区，并具有一定隔离保护条件的，灌溉水源无检疫性有害生物污染的地块。新建玉米繁种基地的，应事先征求当地植物检疫机构的意见。5.2报检建立种苗生产基地的单位和个人，在建立基地前应先向当地植物检疫机构登记、注册，并申请检疫，填写《种子生产基地植物检疫申请表》(表1)。有特殊原因，需临时设立种苗生产基地的，应在播种前向当地植物检疫机构申请检疫。繁育基地经当地检疫部门实地考察合格后，种子繁育单位应在播种栽植前向当地植物检疫部门申请产地检疫，填写玉米种子产地检疫申请表(表2)。表1种子生产基地植物检疫申请表DB3701/T102-20074植检（植保）站：兹拟建立下列种苗生产基地，特报请种子生产基地检疫。基地地址基地面积生产作物品种计划年限负责人申请单位（人）（签章）：联系人：联系电话：年月日表2种苗产地检疫申报表申报单位：联系人：时间：电话：繁育地点作物名称品种种植面积（亩）种苗来源预计产种量省、市、县乡(镇)村户主名称6检疫管理及要求6.1制种地应选用健康种子，调入种子应附有植物检疫证书并报请当地植物检疫部门验证或复检。6.2选用抗病品种，播种前还必须对种子进行消毒处理（消毒处理方法详见附录A）。6.3制种地的防病措施6.3.1制种田与其他普通玉米种植田之间要具有一定的隔离条件。6.3.2制种地不得使用病田秸秆饲喂牲口的粪肥和用病田秸秆沤制的肥料。严禁和邻近田块串灌或大水漫灌。6.4种苗生产单位和个人在种苗生产过程中，若发现疫情，应及时报告当地植物检疫机构，并在植物检疫部门的监督指导下及时作除害处理。DB3701/T102-200756.5制种地收获的种子应凭有效期内的产地检疫合格证收贮，严防与有病种子混杂；所育种子符合（国标）农作物质量标准GB4401.1-1996。7田间检验7.1检验人员由各级专职检疫员为主，玉米繁育单位技术人员协助进行。7.2检查时间制种田分二次进行检查。第一次在生长盛期（8月上中旬），多为病害流行时期，症状明显，易于识别；第二次在成熟前期。7.3检查方法检验人员对制种地需逐块、逐行进行检查。对疑似发生检疫性有害生物的点片有针对性的进行调查；对发现可疑性有害生物的地块采取随机取样调查的方法，每块地采取多点（5点以上）随机取样调查，每点取(15-20)株，计算发病率及发病程度。检查后将检查结果填入“玉米种子田间检验记录表（表3）”。表3玉米种子产地检疫调查记载表报检单位（人）：种植地点作物品种名称作物生育期种植面积预计产量调查日期调查方法调查面积检疫性有害生物及其发生程度其他病虫发生情况调查人名称程度名称程度名称程度名称程度第一次第二次7.4调查中，如发现检疫性有害生物植株，立即拔除，集中销毁，并通知生产单位进行彻底除害处理，所收种子该作他用。7.5症状诊断田间症状识别（详见附录B）。见可疑症状，采集整株标本带回室内检验鉴定。7.6签证经最后一次田间检查后，未发现检疫性有害生物的玉米种子，由当地植物检疫部门签发《产地检疫合格证》（见附录D）。种子生产部门凭《产地检疫合格证》收购种子。8室内检验DB3701/T102-200768.1抽样检验制种地经田间检验合格，种子收获后，必须抽样进行室内检验（取样数量、方法符合GB15569-1995农业植物调运检疫操作规程，检验方法详见附录C），检验结果填入“玉米种子室内检验报告单（表4）”。表4室内检验报告单送检日期检验日期送检单位标本编号应检性有害生物检验数量检验方法检验结果检验人备注检验单位:负责人:8.2签证调运种子生产单位凭有效期内的《产地检疫合格证》及室内检验结果报告单换领调运检疫证书，外调玉米种。DB3701/T102-20077附录A(规范性附录)玉米种子消毒处理方法A.1真菌性病害:玉米霜霉病、玉米干腐病。药剂浸种：防治玉米干腐病，可用40%的福尔马林1kg，加水200kg，配成200倍的稀释液，浸种1小时，然后水洗干净，阴干播种。药剂拌种：在玉米霜霉病发生地区，用内吸性杀菌剂瑞多霉（Apron35DS）进行拌种处理。在玉米干腐病发生地区，带菌种子可用(0.2-0.3)%的赛力散或西力生消毒。A.2细菌性病害：玉米细菌性枯萎病、玉米高氏细菌性萎焉病菌。温水浸种：将玉米种子在60℃的热水中浸15分钟，然后用冷水冷却，晾干。药剂浸种：带菌种子用0.1%氯化汞浸泡20min消毒处理(种子表面消毒)。干热消毒：把带菌种子放在干燥的热空气中(60-70)℃进行干热消毒1h(内、外部消毒)。DB3701/T102-20078附录B(规范性附录)玉米病害田间症状识别B.1玉米霜霉病菌Peronosclerosporaspp.系统侵染性病害，从苗期到成株期均可发病，各种霜指霉侵染引起的症状相似。苗期生长缓慢，节间缩短，植株矮化，重病株不能正常抽穗，或果穗与雄花畸形。叶片上出现淡绿色、淡黄色、苍白色或紫红色的条纹或条斑，宽度不等，多与叶脉平行，以后变色枯死。湿度大时，叶片背面或两面产生灰白色霉层。B.2玉米细菌性枯萎病菌Pantoeastewartiisubsp.stewartiiMergaertetal.系统侵染性维管束病害，典型症状是矮缩和枯萎。苗期感病可导致枯萎死亡，生长后期侵染，植株矮缩。受害病株的导管里充满亮黄色细菌黏液，横切面上可看到渗出的黏液。在甜玉米叶片上形成淡绿色到黄色、具有不规则的或波状边缘的条斑，与叶脉平行，有的条斑可以延长到整个叶片，病斑干枯后成褐色，感病的杂交种玉米植株很快枯萎；雄穗过早抽出并变成白色，在植株停止生长以前枯萎死亡。B.3玉米干腐病Diplodiazeae(Schw.)Lev.玉米的整个生育期皆可发病，但开花后病情加重。病株茎基部(4-5)节节间产生褐色或黑褐色斑块，髓部变褐、腐烂、破碎。叶片上产生不规则长条形褐色病斑。叶鞘病斑深褐色至紫红色，可延伸到茎秆。叶鞘与茎秆间常有白色菌丝。有的病株急性枯死，叶片迅速凋萎，变灰绿色。后期节部和节间产生大量黑色小粒点（病原菌的分生孢子器）。果穗受害后，穗轴变松变轻，苞叶干枯变黄白色。苞叶与果穗间有白色菌丝体，粘连不易剥离。拨开苞叶可见果穗下端或全穗子粒暗褐色，无光泽，子粒间充满灰白色菌丝体。后期子粒上和穗部组织生有黑色小粒点。B.4玉米高氏细菌性萎焉病菌Clavibactormichiganensissubsp.nebraskensisDavisetal.玉米萎焉病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐，与叶脉平行，并扩展到边成长条纹，呈叶灼状。表面常有细菌溢脓。玉米幼苗和成株期均可发病，苗期引起萎焉、死亡。后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有时有黑色斑点，最后干枯。系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。DB3701/T102-20079附录C(规范性附录)玉米种室内检验方法C.1取样对收贮的玉米种子,采用对角线5点取样或分层设点取样（具体取样方法、数量参照农业植物调运检疫规程）。C.2玉米霜霉病菌:洗涤检验:取样品种子100粒,浸入25ml蒸馏水中(加入1滴吐温),振荡10min,用离心机(2500r/min)离心10min,沉淀物用2ml蒸馏水悬浮,镜检至少8滴悬浮液。染色法检验:检查种子组织中是否存在菌丝和卵孢子，步骤如下：浸泡和染色—提取—脱水—分离—透明—检查。（1）取样品种子400粒，在室温（28℃）下浸入11.5%氢氧化钠和0.015%棉蓝乳酚油溶液中24h。（2）把浸泡过的种子在自来水流中搅动，用相连的网眼分别为5㎜、4㎜、3㎜的分样筛分离种子各个部分。胚收集在最底部的分样筛上（注意不要弄坏种子的各个部分）。用手分开种子各个部分，因胚乳部分溶解到碱液中而收集不到。（3）把胚和种皮放在直径为9㎝的染色缸中，分别用精馏酒精脱水2min。（4）把脱水的胚转入带有胶皮管的漏斗中，加入大约20ml的乳酸甘油混合液（乳酸：甘油：水=1：2：1），胚乳在表层，而其他碎片则沉在底部，通过胶皮管把其他碎片放掉。重复洗5-6次，直到其他碎片全部洗掉为止，用刷子和镊子分离种皮。（5）把胚和种皮分别转入装有乳酸+甘油（1：2）的250ml的烧杯中，加热煮沸，然后冷却。（6）用16和40倍的解剖镜检查乳酸甘油混合液中的胚和种皮，并用显微镜检查卵孢子和菌丝；卵孢子被染成蓝色，大小为31-50µm,菌丝通常长而分枝，粗壮、无隔、多核，在一些种子中菌丝段呈原生质团状。种植检验:将种子播于灭菌土壤中，观察幼苗的系统症状，直至出苗5周以后观察确诊。C.3玉米细菌性枯萎病菌的检验方法细菌溢检验切取病叶上病健交界处叶片组织约一毫米，放在载玻片上，滴一滴清水，盖上盖玻片，放在低倍镜稍暗视野下检查，是否有云雾状菌液自病部溢出。分离培养检验1.从病株上分离：在新鲜病斑边缘切取部分组织，用常规方法分离培养病原细菌；在营养琼脂培养基上菌落小、圆形、生长慢、黄色、表面平滑。2.从土壤、病残组织和昆虫体内分离：从土壤、病残组织和昆虫体内分离病原细菌时，由于杂菌污染的可能性大，通常采用伊凡诺夫选择性培养基分离。伊凡诺夫选择性培养基（pH7.2）：甘油30ml，柠檬酸铁铵10g，牛胆酸钠3g，氯化钠15g，蒸馏水1000ml，硫酸钠2.5g，硫酸镁0.1g，琼脂17g，氯化钙0.01g，磷酸二氢钾2.5g。3.从种子中分离：选取玉米种子样品，用95%乙醇洗净种子表面，用无菌水冲洗几遍，然后在无菌容器中破碎，加入适量的0.01mol/L(pH7.2)的PBS，在4℃下浸泡过夜。浸泡液DB3701/T-2002DB3701/T102-200710经纱布过滤和差速离心浓缩，然后用523培养基或改良W氏培养基做稀释平板分离。523培养基：蛋白胨8g,酵母粉4g,MgSO4·H2O0.3g,蒸馏水1000ml，蔗糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂粉18g,pH7.0～7.1；改良W氏培养基：蛋白胨5g,蒸馏水1000ml，蔗糖10g，磷酸氢二钾0.5g，MgSO4·H2O0.25g,琼脂粉18g，抗坏血酸1g,pH7.2～7.4