PCR荧光检测试剂盒生产质控作业规程

程序操作检查操作1混匀办法每一次提示注意倒置混匀、移液器吹打、震荡，50000rpm离心1分钟。PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程一.微量加样器使用规定1.微量加样器校正：：使用微量加样器吸10μl10次与否为100μl。2.加样前吸头润湿：当吸头排空时，仍会有某些残留液体以薄膜形式吸附在吸头里面，因此，在加样时先吸打液体多次，充分润湿吸头管腔,以保证加样一致性。3.加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头液体顺着管壁流出，防止液滴形成由于其表面张力作用而制止样本释放。4.吸头与否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。5.加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一停点，缓慢慢慢吸入液体。停留1s，然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸嘴外面也许黏附液滴。放液时通过第一停点，停1-2s后，继续按压到第二停点，排出残存液体。6.PCR反映原液由于有甘油在冷状态较黏稠,易于1次吸取数人份，慢某些。7.边加边看,直观预计,防止跳管。8.低温冷藏批量DNA提取液、PCR反映液A和B取出时与否充分混匀后,分装使用，PCR反映液A和B与否避光低温冷藏和使用。9.配PCR反映液应先加缓冲液再加PCR反映液充分混匀,必要时倒置混匀,再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。10.PCR反映液（涉及样品）应充分混匀:保证PCR反映曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。二．PCR实验操作规程2取血清样本1）因水分蒸发变浓2）冻状、混浊按（1）法混匀,再取25µl加水5µl混匀。温水浴37℃溶解按（1）法混匀,或1rpm离心5分钟，取清液。3取质控品冻状、混浊温水浴37℃溶解按（1）法混匀或1rpm离心5分钟，取清液。4血清样本稀释混匀血清阴性血清40µl加阳性血清10µl，按（1）法混匀。5倍稀释5质控品稀释混匀质控品血清稀释液40µl加质控品10µl，按（1）法混匀5倍稀释。6血清样本DNA取提DNA提取液完好血清样本按（1）法混匀，取30µl加DNA提取液60µl，按（1）法混匀，98℃8分钟变性，0℃冷却2-3分钟，1rpm，离心10分钟,吸取上清液。7质控品DNA变性分装，有效，呈清液状态，未重复加热、冻融质控品按（1）法混匀，取30µl5000rpm离心1分钟，98℃5分钟变性,5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。8PCR反映液混匀状态取25µl反映液加5µl提取DNA，按（1）法混匀，5000rpm离心1分钟，5000rpm，离心1分钟,吸取上清液。9PCR反映室温10-30℃PCR反映槽四角不放管。10设阴性对照阴性混匀血清CT〉3811阳性参照品各浓度呈梯度以PCRA反映液制作原则曲线，呈直线。12阴性质控品B各浓度呈梯度以PCRA和B反映液制作原则曲线，呈直线。**血清稀释液：全阴性血清再加2倍HBVDNA提取液混匀，5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃5分钟变性,1rpm，离心10分钟,吸取上清液。三.超净工作台使用、维护保养与清洁原则操作规程1.目建立一种超净工作台使用、维护保养与清洁原则操作程序，使操作过程原则化。2.职责质量部QC负责本文献起草，质量部及QC检查人员负责本原则实行。3.范畴本原则合用于超净工作台使用、维护和保养与清洁。4.内容4.1超净工作台重要构成某些：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道某些。4.2安放点选取：4.2.1应安放于卫生条件较好地方，便于清洁，门窗可以密封以避免外界污染空气对室内影响。4.2.2安放位置应远离有震动及噪音大地方。4.2.3禁止安放在产生大尘粒及气流大地方，以保证操作区空气正常流动。4.3使用前检查：4.3.1接通超净工作台电源。4.3.2旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出风面与否有风送出。4.3.3检查照明及紫外设备能否正常运营，如不能正常运营则告知工程部检修。4.3.4工作前必要对工作台周边环境及空气进行超净解决，认真进行清洁工作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌解决。4.3.5净化工作区内禁止存储不必要物品，以保持干净气流流动不受干扰。4.4使用：4.4.1使用工作台时，先通过清洁液浸泡纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。4.4.2接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，解决净化工作区内工作台表面积累微生物，30分钟后，关闭紫外灯，启动送风机。4.4.3工作台面上，不要存储不必要物品，以保持工作区内干净气流不受干扰。4.4.4操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。4.4.5最后启动工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。4.4.6每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术原则，应调节调压器手柄，变化风机输入电压，使工作台处在最佳状况。4.4.7每月进行一次维护检查，并填写维护记录。4.5清洁4.5.1每次使用完毕，及时清洁仪器，悬挂标记，并填写仪器使用记录。4.5.2取样结束后，先用毛刷刷去干净工作区杂物和浮尘。4.5.3用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干。4.5.4要经惯用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力.4.5.5效果评价:设备内外表面应当光亮整洁，没有污迹。四.检查办法操作规范1.混匀：反映液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后5000rpm离心数秒(按原阐明进行)。2.精确：反映液及样本混匀后,每一步加样精确(按原阐明进行)。3.新鲜血清样本：血清样本混匀后离心（5000rpm离心数秒），取30μl，加2倍量DNA提取液60μl混匀100℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀，再取5μl加样。4.长期放置冰箱冷藏血清样本：取25μl，加无菌水5μl加2倍量DNA提取液60μl混匀98℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀，再取5μl加样.5.DNA提取液解决并冷藏保存血清样本：DNA提取液解决：血清样本混匀，取200μl，加DNA提取液400μl混匀98℃5分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟，1rpm离心5分钟，取出所有上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100μl/管分装冷藏保存.保存血清样本使用：取1管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀，5000rpm离心数秒，再取30-40μl98℃5-6分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟，5000rpm离心数秒，再取5μl加样.6.质粒DNA关于质控品（P和N）：用全阴性血清与质粒DNA按9:1混匀，5000rpm，离心1分钟,再加2倍HBVDNA提取液混匀，5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃5分钟变性,1rpm，离心10分钟,吸取上清液，取出所有上清液置另1管混匀，冷藏保存，按100μl/管分装冷藏保存.关于质控品使用：取1管分装冷藏保存质控品，融化后混匀，5000rpm离心数秒，再取30-40μl98℃5-6分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟，5000rpm离心数秒，再取5μl加样.五.防止荧光定量PCR产物污染质控规程1.目规范荧光定量PCR实验和生产操作过程，保证操作过程中无PCR产物污染。2.合用范畴本规范合用于荧光定量PCR实验和生产操作过程。该规程参照中华人民共和国《艾滋病核酸检测技术规范》。3.职责划分操作人员按照此原则操作规范进行荧光定量PCR实验和生产，质检部经理负责监督。4.质量保证体系4.1实验室和生产工作区质控体系4.1.1实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备区(GMP车间超净工作室)、样品解决区（质检室1）、扩增区（质检室2）和扩增产物分析区（质检室3）。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区功能是：(1)样品解决区：样品登记、分装。各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提取、保存和加样。（2)试剂准备区：PCR扩增试剂配制、分装和保存。(3)扩增区：普通PCR扩增及荧光定量PCR扩增。(4)扩增产物分析区：PCR扩增产物电泳、杂交、成像、测定、成果分析、报告。4.1.2用有效办法对操作区域和共用器具在实验先后进行清洁及消毒推荐程序是：a.实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除。b.移入盛放污染材料器皿、所需试剂、耗材和样品，进行实验。c.一种实验区域在同一时间段只进行一种实验。d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。4.1.3实验工作区内必要穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根据规定戴不同规格手套。4.1.4PCR产物分析使用相对封闭系统或共用分析软件时，如特定凝胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件，每位实验人员都要精确命名自己设立程序及分析成果，使用完毕后需收拾好所用仪器并保存好自己实验分析成果。4.1.5各区域仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。4.2荧光定量PCR扩增实验过程控制体系：4.2.1样品采集和解决4.2.1.1用于普通PCR或荧光定量PCR检测样品有细胞、全血、血浆、各种组织和其她分泌物，有时还涉及生物制品。4.2.1.2采集样品应避免微生物和核酸污染（所用器皿必要无菌或属于一次性用品，RNA类样品所用器皿必要没有RNA酶污染）。4.2.1.3解决样品应在样品解决区由专人进行。解决和保存用于抽提DNA或RNA样品应避免DNA或RNA酶导致降解，普通规定在采样后1小时内解决并低温保存。4.2.1.4解决后样品应分装、标记（需用防水笔填写），并做好实验记录，冻存于-20℃如下，DNA或RNA类样品应冻存于-60℃或保存在液氮中。4.2.2核酸（RNA/DNA）提取4.2.2.1应在规定区域内由专人按相应程序进行。4.2.2.2应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应通过消毒解决并一次性使用。4.2.2.3提取RNA时应避免RNA酶污染，抽提RNA样品实验使用移液器及离心管等用品必要用DEPC解决，去除RNA酶。4.2.2.4配制RNA逆转录或DNA反映试剂，所有操作超过10分钟时应将反映管置于冰盒内，防止各种酶及样品DNA或RNA降解。4.2.3.3进行逆转录反映时应避免RNA酶污染，实验使用移液器及离心管等用品必要用DEPC解决，去除RNA酶。4.2.3.4扩增仪应预热，时间不少于20分钟。4.2.3.5进行内参基因扩增（β－actin或GAPDH），并设立递增PCR循环数，电泳拟定逆转录效率及CDNA样品起始浓度，为荧光定量PCR实验做准备，成功逆转录样品在PCR扩增时25个循环即可见清晰内参条带。4.2.4荧光定量PCR实验：4.2.4.1应在样品解决区内加样。迅速精确将样品DNA或RNA小心加入装有反映液体反映管内，盖紧盖子并做好标记。4.2.4.2操作超过10分钟时应将反映管置于冰盒内，防止酶降解及副反映发生。4.2.4.3严格按照荧光定量PCR仪操作手册启动机器，设立实验扩增程序，保存文献，最佳以日期及样品名称命。PCR扩增仪应预热，时间不少于20分钟。4.2.4.5将反映管置于扩增仪上，开始扩增。4.2.4.6反映结束时停止实验程序，取出反映产物，－20℃保存。4.2.4.7扩增成果分析和定量按照操作手册进行，对三孔平行实验成果必要一方面判断其与否精确（孔间差别0.3时应考虑舍弃该孔数据，并重新进行该样品荧光定量PCR实验），然后依照原则曲线计算出各样品浓度。4.2.7.8成果报告中应注明使用实验办法、实验试剂、实验仪器及样品种类和样品量。4.3客户沟通质量体系：4.3.1收到样品后，由专业负责人进行样品清点和整顿工作，以保证样品数目精确性和样品有效性。如有问题，应及时与客户进行沟通。4.3.2在保证样品无误和有效状况下，由专业技术人员进行样品解决工作―――核酸抽提工作（按照原