LS∕T 6138-2020 粮油检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 免疫磁珠净化超高效液相色谱法

书书书犐犆犛６７．０４０犡１１中华人民共和国粮食行业标准犔犛／犜６１３８—２０２０粮油检验　粮食中黄曲霉毒素的测定免疫磁珠净化超高效液相色谱法犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵狉犪犻狀犪狀犱狅犻犾狊—犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犳犾犪狋狅狓犻狀狊犻狀犵狉犪犻狀狊犪狀犱狅犻犾狊—犝犾狋狉犪犺犻犵犺犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狑犻狋犺犻犿犿狌狀狅犿犪犵狀犲狋犻犮犫犲犪犱犮犾犲犪狀狌狆２０２００１２１发布２０２００７２１实施国家粮食和物资储备局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（ＳＡＴ／ＴＣ２７０）归口。本标准起草单位：国家粮食和物资储备局科学研究院、国家粮食和物资储备局标准质量中心、北京东孚久恒仪器技术有限公司、中国储备粮管理集团有限公司、山东省粮油检测中心、广西壮族自治区粮油质量检验中心、四川省粮油中心监测站、河南口岸食品检测中心、遂宁市粮食质量监督检验站、安徽省粮油产品质量监督检测站、河南省粮油饲料产品质量监督检测中心、福建省粮油质量监测所、湖北省粮油食品质量监督检测中心、辽宁省粮油检验监测所、黑龙江省粮食质量安全监测中心、山西粮食质量监测中心、云南省粮油产品质量监督检验测试中心、内蒙古自治区粮油质量检测中心、昆明市粮油饲料产品质量检验中心、北京农业质量标准与检测技术研究中心、哈尔滨市粮食质量监测站、前郭尔罗斯蒙古族自治县粮油品质卫生检验监测站。本标准主要起草人：王松雪、叶金、轩志宏、杨卫民、李克强、张志航、周明慧、王培、伍先绍、杨军、姬建生、李小明、胡斌、刘莹、谢婷婷、田国军、韩笑、徐春峰、李静、邵志凌、邱庆丰、李维香、陆安祥、赵宏伟、赵环宇。Ⅰ犔犛／犜６１３８—２０２０粮油检验　粮食中黄曲霉毒素的测定免疫磁珠净化超高效液相色谱法１　范围本标准规定了免疫磁珠净化超高效液相色谱测定粮食中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２（ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１、ＡＦＧ２）的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、测定、结果计算和精密度等内容。本标准适用于小麦、玉米、稻谷和植物油等粮油样品中ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１和ＡＦＧ２的测定。本标准ＡＦＢ１的检出限为０．１μｇ／ｋｇ，ＡＦＢ２的检出限为０．０３μｇ／ｋｇ，ＡＦＧ１的检出限为０．１μｇ／ｋｇ，ＡＦＧ２的检出限为０．０３μｇ／ｋｇ；ＡＦＢ１的定量限为０．３μｇ／ｋｇ，ＡＦＢ２的定量限为０．１μｇ／ｋｇ，ＡＦＧ１的定量限为０．３μｇ／ｋｇ，ＡＦＧ２的定量限为０．１μｇ／ｋｇ。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ５４９０　粮油检验　一般规则ＧＢ／Ｔ５４９１　粮食、油料检验　扦样、分样法ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　原理样品中黄曲霉毒素经甲醇水混合液提取、上清液经免疫磁珠净化、富集后，采用超高效液相色谱分析，外标法定量。４　试剂和材料除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中规定的一级用水要求。４．１　乙腈：色谱纯。４．２　甲醇：色谱纯。４．３　氯化钠。４．４　磷酸氢二钠。４．５　磷酸二氢钾。４．６　氯化钾。４．７　盐酸。４．８　ＴｒｉｔｏｎＸ１００［Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）狀］（或吐温－２０，Ｃ５８Ｈ１１４Ｏ２６）。４．９　甲醇水混合液７０∶３０，体积分数取７０ｍＬ甲醇加入３０ｍＬ水，混匀。４．１０　磷酸盐缓冲溶液（以下简称ＰＢＳ）：称取８．００ｇ氯化钠、１．２０ｇ磷酸氢二钠（或２．９２ｇ十二水磷酸氢二钠）、０．２０ｇ磷酸二氢钾、０．２０ｇ氯化钾，用９００ｍＬ水溶解，用盐酸调节ｐＨ至７．４，用水定容至１０００ｍＬ。１犔犛／犜６１３８—２０２０４．１１　０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（或吐温２０）的ＰＢＳ溶液（以下简称ＰＢＳＴ）：取１ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ１００（或吐温２０），用ＰＢＳ定容至１０００ｍＬ。４．１２　标准品黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２的固体粉末（纯度≥９９％）或经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液。４．１３　标准溶液配制４．１３．１　混合标准溶液分别准确移取一定体积或质量的４种黄曲霉毒素标准品（４．１２）于１０ｍＬ容量瓶中，配制黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２，浓度分别为１００ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ，用甲醇定容至刻度，此溶液－２０℃密封避光保存，有效期６个月。４．１３．２　标准系列工作溶液分别准确移取４种黄曲霉毒素混合标准溶液（４．１３．１）２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２５０μＬ、５００μＬ、１０００μＬ分别于１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制标准曲线溶液浓度见表１，此溶液４℃避光密封保存，有效期１周。表１　标准曲线溶液浓度单位：ｎｇ／ｍＬ化合物名称标曲点１标曲点２标曲点３标曲点４标曲点５标曲点６ＡＦＢ１０．２５０．５１２．５５１０ＡＦＢ２０．０７５０．１５０．３０．７５１．５３ＡＦＧ１０．２５０．５１２．５５１０ＡＦＧ２０．０７５０．１５０．３０．７５１．５３４．１４　塑料离心管（２．０ｍＬ、１０ｍＬ、５０ｍＬ）。４．１５　玻璃内插管（４００μＬ）。４．１６　色谱进样瓶（２ｍＬ）。４．１７　容量瓶（１０ｍＬ）。４．１８　黄曲霉毒素免疫磁珠前处理试剂盒：回收率≥８５％。注：对于不同批次的试剂盒在使用前需进行质量验证。５　仪器和设备５．１　天平：感量０．１ｍｇ和０．０１ｇ。５．２　粉碎机：电机转速≥１０００ｒ／ｍｉｎ，可使试样粉碎后全部通过２０目筛。５．３　离心机：转速≥６０００ｒ／ｍｉｎ。５．４　涡旋混合器。５．５　振荡器（振荡频率≥５０次）。５．６　单通道移液枪一套（最大量程分别为２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ）。５．７　分液器（量程１０～１００ｍＬ）。５．８　磁棒和磁棒套或含有磁棒和磁棒套的全自动净化仪。５．９　超高效液相色谱荧光检测器（带一般体积流动池或者大体积流通池）。注：当带大体积流通池时不需要再使用任何型号或任何方式的柱后衍生器。５．１０　柱后衍生器。２犔犛／犜６１３８—２０２０６　分析步骤６．１　扦样与分样按ＧＢ／Ｔ５４９１执行，在采样过程中，注意防止样品污染，取代表性样品至少１ｋｇ。６．２　样品制备６．２．１　液体样品（植物油）将所有液体样品在一个容器中充分混合均匀，储存于样品瓶中备用。６．２．２　固体样品（小麦、玉米、稻谷等）用粉碎机（５．２）将样品粉碎至全部通过２０目筛，充分混合均匀，储存于样品瓶中备用。６．３　提取及净化准确称取５ｇ（精确到０．０１ｇ）样品于５０ｍＬ离心管中，加入２０ｍＬ提取液（４．９），涡旋提取２０ｍｉｎ，然后以６０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸取０．５ｍＬ上清液于１０ｍＬ反应管中，加入４．５ｍＬＰＢＳＴ（４．１１）并混匀，加入１００μＬ黄曲霉毒素免疫磁珠振荡反应５ｍｉｎ，通过磁棒（５．８）磁吸分离３０ｓ后将免疫磁珠转移至含１ｍＬＰＢＳＴ（４．１１）的２ｍＬ反应管振荡１ｍｉｎ，通过磁棒磁吸分离３０ｓ后将免疫磁珠转移至含１ｍＬＰＢＳ（４．１０）的２ｍＬ反应管振荡１ｍｉｎ后，通过磁棒磁吸分离３０ｓ后将免疫磁珠转移至含０．５ｍＬ甲醇（４．２）的２ｍＬ反应管振荡１ｍｉｎ，通过磁棒磁吸分离３０ｓ后弃去免疫磁珠，收集甲醇于进样瓶中以备进样。注１：使用不同厂商的免疫磁珠时在操作方面可能有所不同，应按照其使用说明要求进行操作。注２：真菌毒素全自动净化仪可优化操作参数后使用。７　测定７．１　液相色谱参考条件７．１．１　无衍生器法（大流通池直接检测）色谱参考条件：色谱柱：Ｃ１８柱（柱长５０ｍｍ或１００ｍｍ，柱内径２．１ｍｍ，填料粒径１．７μｍ），或性能相当。荧光检测波长：激发波长３６０ｎｍ；发射波长４４０ｎｍ。流动相：Ａ：甲醇，Ｂ：水。等度洗脱，Ａ∶Ｂ＝４０∶６０。流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ。柱温：３０℃。进样量：２μＬ。７．１．２　柱后衍生法色谱参考条件：色谱柱：Ｃ１８柱（柱长５０ｍｍ或１００ｍｍ，柱内径２．１ｍｍ，填料粒径１．７μｍ），或性能相当。荧光检测波长：激发波长３６０ｎｍ；发射波长４４０ｎｍ。流动相：Ａ∶甲醇，Ｂ∶水。等度洗脱，Ａ∶Ｂ＝４０∶６０。３犔犛／犜６１３８—２０２０流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ。柱温：３０℃。进样量：２μＬ。柱后衍生器。７．２　标准曲线的制作黄曲霉毒素标准工作溶液（４．１３．２）由低浓度到高浓度依次注入液相色谱检测分析。以黄曲霉毒素标准工作液浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为纵坐标，得到标准线性回归方程。７．３　试样溶液的测定待测样液（６．３）中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析。８　结果计算样品中黄曲霉毒素的含量按式（１）计算：犡＝犮×犞１×（犞２＋犞３）×犞４犿×犞２……………………（１）　　式中：犡　———样品中ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１或ＡＦＧ２的含量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———由标准曲线测得试样中ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１或ＡＦＧ２的含量，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞１———提取液的体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞２———用于稀释的提取液体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞３———用于稀释的稀释液体积，单位为毫升（ｍＬ）；犞４———用于免疫磁珠的洗脱液体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———样品的称样量，单位为克（ｇ）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，保留３位有效数字。测定结果不符合重复性要求时，应按ＧＢ／Ｔ５４９０的规定重新测定，计算结果。９　精密度９．１　重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值小于或等于重复性限（狉）的情况应大于９５％，黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２含量的重复性限值（狉）参见附录Ｂ。９．２　再现性在再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值小于或等于再现性限（犚）的情况应大于９５％，黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２含量的再现性限值（犚）参见附录Ｂ。４犔犛／犜６１３８—２０２０附　录　犃（资料性附录）黄曲霉毒素标准溶液超高效液相色谱图黄曲霉毒素标准溶液超高效液相色谱图见图Ａ．１。图犃．１　黄曲霉毒素犅１、犅２、犌１、犌２（浓度比例１０∶３∶１０∶３）标准谱图５犔犛／犜６１３８—２０２０附　录　犅（资料性附录）实验室间比对试验统计结果组织６家实验室对６个不同样品进行实验室间比对试验，建立了本方法的精密度，结果按ＧＢ／Ｔ６３７９．１和ＧＢ／Ｔ６３７９．２统计分析，统计结果见表Ａ．１和表Ａ．２。表犅．１　玉米加标实验室间黄曲霉毒素的测量结果样品玉米低浓度玉米中浓度玉米高浓度毒素ＡＦＢ１ＡＦＢ２ＡＦＧ１ＡＦＧ２ＡＦＢ１ＡＦＢ２ＡＦＧ１ＡＦＧ２ＡＦＢ１ＡＦＢ２ＡＦＧ１ＡＦＧ２参加实验室的数目６６６６６６６６６６６６样品的数量１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８去除离群值后的测试实验室数量６６６６６６６６６６６６所有可接受结果的数量１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８平均值μｇ／ｋｇ１０．５８２．６８１０．２２２．５５２０．７３５．２３２０．３９４．９４４１．６５１０．５２４０．０７９．６６重复性的标准偏差犛狉μｇ／ｋｇ０．５６０．０９０．６００．１６０．８２０．１７０．９９０．１４１．８６０．５２２．１１０．５４重复性的变异系数％５．３３．５５．９６．４４．０３．２４．９２．９４．５５．０５．３５．６重复性限值狉μｇ／ｋｇ１．５９０．２６１．７１０．４６２．３３０．４７２．８００．４０５．２８１．４８５．９６１．５４再现性标准偏差犛犚μｇ／ｋｇ０．７９０．１９０．７８０．２３１．５５０．４１１．１７０．３６２．７２０．８１２．４９０．８５再现性的变异系数％７．５７．１７．６８．９７．５７．８５．８７．２６．５７．７６．２８．８再现性限值犚μｇ／ｋｇ２．２３０．５４２．２００．６