GB∕T 38480-2020 微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定 菌丝生长速率法

书书书犐犆犛０７．０８０犃２１!#$%&’’()*犌犅／犜３８４８０—２０２０!#$%&’()*+#%,-./01　-23456犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪狀狋犻犳狌狀犵犪犾犪犮狋犻狏犻狋狔犳狅狉犿犻犮狉狅犫犻犪犾狊犲犮狅狀犱犪狉狔犿犲狋犪犫狅犾犻狋犲狊—犕狔犮犲犾犻犪犾犵狉狅狑狋犺狉犪狋犲犿犲狋犺狅犱２０２０１１１９78２０２０１１１９9:’(+,-./012’()*3/045678书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院。本标准主要起草人：申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、崔海峰、张雅芬、许益鹏。Ⅰ犌犅／犜３８４８０—２０２０微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定　菌丝生长速率法１　范围本标准规定了用菌丝生长速率法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性的方法。本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１抑制中浓度　犿犲犱犻犪狀犻狀犺犻犫犻狋狅狉狔犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀ＩＣ５０对真菌生长的抑制率达到５０％时的浓度。３．２抗真菌活性　犪狀狋犻犳狌狀犵犪犾犪犮狋犻狏犻狋狔抗制真菌生长繁殖的能力。４　原理将供试次生代谢产物与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量次生代谢产物抑丝状真菌的能力，通过计算ＩＣ５０来判定活性。５　试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。５．１　水。ＧＢ／Ｔ６６８２一级水。５．２　马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）。称取马铃薯浸粉３．０ｇ、葡萄糖２０．０ｇ、琼脂２０．０ｇ，然后将上述各成分加入１０００ｍＬ蒸馏水中，煮沸溶解，ｐＨ自然，分装至２５０ｍＬ锥形瓶中，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，备用。也可采用市售的商业培养基。５．３　指示菌标准菌株：立枯丝核菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻Ｋüｈｎ）ＡＴＣＣ７６１４５。根据微生物源抗生素类次生代谢产物应用领域不同，也可以采用其他菌株作为供试菌。１犌犅／犜３８４８０—２０２０６　仪器设备６．１　恒温培养箱：温度偏差在±１℃以内。６．２　超净工作台。６．３　无菌培养皿：直径９０ｍｍ。６．４　测量仪：游标卡尺，精度０．１ｍｍ。６．５　无菌打孔器：内径５ｍｍ±０．１ｍｍ。６．６　无菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器。７　操作步骤７．１　指示菌培养倾注融化并经１２１℃灭菌冷却至５５℃左右的ＰＤＡ固体培养基１５ｍＬ于无菌培养皿内，待其凝固后制成ＰＤＡ平板，将立枯丝核菌冻存菌株用无菌接种针挑取少量菌丝接种到ＰＤＡ平板中间，２８℃±１℃恒温培养箱培养至菌丝覆盖整个平板，备用。上述操作均在超净工作台内进行。７．２　供试样品制备极性样品直接用水充分溶解（非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解），配制成一定浓度的母液，经无菌０．４５μｍ滤膜过滤，然后用无菌水（或相应的表面活性剂）按２倍或５倍浓度逐级稀释，制备成至少５个不同浓度的待测溶液，逐级稀释时应确保既有抑制率大于５０％分布的浓度点，也有抑制率小于５０％分布的浓度点，现配现用。７．３　检测平板制备将７．２中制备的供试样品分别用冷却至５５℃±１℃的ＰＤＡ培养基按１∶９的比例稀释，充分混匀后用无菌吸管各取１０ｍＬ移至无菌培养皿内，轻轻摇动培养皿使其均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，用对应的溶剂和ＰＤＡ混合制备的平板作为空白对照平板，备用。７．４　抑菌活性测定用无菌打孔器（内径５ｍｍ±０．１ｍｍ）在活化的指示菌平板中相同的半径边缘打孔，用无菌镊子取菌饼正置于７．３制备的检测平板中间。每个处理重复５次。将平板正置于２８℃±１℃恒温培养箱中培养２４ｈ～４８ｈ，取出，采用十字交叉法测量菌落直径，两次测量所得的平均值即为菌落直径。８　结果计算抑制率按式（１）计算：犐＝（犇１－５）－（犇２－５）犇１－５×１００％…………………………（１）　　式中：犐———抑制率；犇１———空白对照平板中形成的菌落直径，单位为毫米（ｍｍ）；犇２———供试次生代谢产物平板中形成的菌落直径，单位为毫米（ｍｍ）。以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位。２犌犅／犜３８４８０—２０２０根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线犢＝犪犡＋犫，其中犢为抑制率的概率值，犡为药剂浓度对数值，犪为回归曲线斜率，犫为常数，并给出回归曲线的犚２值，计算供试药剂对立枯丝核菌的ＩＣ５０值。９　重复性在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。犌犅／犜３８４８０—２０２０