SF∕T 0066-2020 生物检材中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的液相色谱-串

ICS07.140C06SF中华人民共和国司法行政行业标准SF/T0066—2020生物检材中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的液相色谱-串联质谱检验方法Determinationof31fentanyl-analogueandtheirmetabolitesinbiologicalsamplesbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry2020-05-29发布2020-05-29实施中华人民共和国司法部发布SF/T0066—2020I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14原理..............................................................................15试剂、仪器和材料..................................................................16操作方法..........................................................................37分析结果评价......................................................................8附录A（资料性附录）31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的提取离子色谱图...........10附录B（资料性附录）方法学有效性验证数据...........................................17SF/T0066—2020II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由司法鉴定科学研究院提出。本标准由司法部信息中心归口。本标准起草单位：司法鉴定科学研究院。本标准主要起草人：施妍、向平、刘伟、沈保华、严慧、卓先义、沈敏、吴何坚。SF/T0066—20201生物检材中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的液相色谱-串联质谱检验方法1范围本标准规定了血液、尿液、毛发中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检验的试剂、仪器和材料、操作方法以及分析结果评价等要求。本标准适用于血液、尿液及毛发中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的定性与定量分析，其它检材中芬太尼等31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物的定性及定量分析可参照使用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GA/T122毒物分析名词术语3术语和定义GA/T122中确立的术语和定义适用于本文件。4原理血液、尿液、毛发样品经有机溶剂提取后，采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)进行检测，经与平行操作的空白样品和添加样品作对照，以两对母离子/子离子对的保留时间、相对丰度比进行定性分析；以定量离子对峰面积为依据，采用内标法进行定量分析。5试剂、仪器和材料5.1试剂试验用水应为符合GB/T6682规定的一级水，所用试剂和要求如下：a)甲醇：HPLC级；b)乙腈：HPLC级；c)98%甲酸：优级纯；d)乙酸铵：色谱纯；e)丙酮：分析纯；f)标准物质溶液：SF/T0066—202021)标准物质储备液：市售芬太尼（Fentanyl）、去甲基芬太尼（Norfentanyl）、阿芬太尼（alfentanil）、乙酰去甲基芬太尼（Acetylnorfentanyl）、3-甲基硫代芬太尼（3-methylthiofentanyl）、反-3-甲基芬太尼（trans-3-methylfentanyl）、α-甲基芬太尼（α-methylfentanyl）、β-羟基芬太尼（β-hydroxyfentanyl）、β-羟基-3-甲基芬太尼（β-hydroxy-3-methylfentanyl）、硫代芬太尼（thiofentanyl）、THF-F标准品溶液，质量浓度均为1mg/mL；去丙烯酰芬太尼[N-phenyl-1-（2-phenylethyl）-4-piperidinamine，4-ANNP]、去甲基卡芬太尼（Norcarfentanil）、丙烯酰芬太尼（Acrylfentanyl）、丁酰芬太尼（Butyrylfentanyl）、异丁酰芬太尼（Isobutyrylfentanyl）、对-氟芬太尼（para-fluorofentanyl）、邻-氟芬太尼（para/ortho-fluorofentanyl）、cis-3-甲基芬太尼（cis-3-methylfentanyl）、β-羟基硫代芬太尼（β-hydroxythiofentanyl）、戊酰芬太尼（Valerylfentanyl）、对-氟丁酰芬太尼[para-flurorbutyrylfentanyl（PFBF）]、4-氟异丁酰芬太尼（4-Fluoro-isobutyrylfentanyl）、奥芬太尼（Ocfentanil）、呋喃芬太尼（Furanylfentanyl）、瑞芬太尼（Remifentanil）、舒芬太尼（Sufentanil）、卡芬太尼（Carfentanil）、甲氧乙酰芬太尼（Methyoxyacetylfentanyl）、环丙基芬太尼（Cyclopropylfentanyl）、乙酰芬太尼（Acetylfentanyl）标准品溶液，质量浓度均为100μg/mL；置于冰箱中冷冻保存，保存时间为12个月；2)标准物质工作溶液：试验中所用其它浓度的标准工作溶液均从5.1f）1）所述标准物质溶液用甲醇稀释而得。密封，置于冰箱中冷藏保存，保存时间3个月。g)内标溶液：1)内标储备液：市售1.0mg/mL芬太尼-D5（Fentanyl-D5）和去甲基芬太尼-D5（Norfentanyl-D5）标准品溶液（或其他性质相近物），置于冰箱中冷冻保存，保存时间12个月；2)内标工作溶液：试验中所用其它浓度的内标工作溶液均从上述内标储备液用甲醇稀释而得。密封，置于冰箱中冷藏保存，保存时间3个月。h)提取溶液：1)2mmol/L甲酸铵溶液（含8%乙腈，pH5.3）：称取甲酸铵适量，加乙腈20mL，用去离子水定容至250mL，用0.1%甲酸调节pH至5.3，即得2mmol/L甲酸铵溶液；2)提取溶液：取甲醇、乙腈和2mmol/L甲酸铵溶液（含8%乙腈，pH5.3）适量配制体积比为1:1:5的溶液。5.2仪器和材料仪器和材料及要求如下：a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)；b)电子分析天平：分度值0.1mg；c)离心机：最大相对离心力14100×g；d)超声波清洗仪；e)离心管及研磨管；f)滤膜：0.22μm；g)冷冻研磨仪；h)微量移液器。SF/T0066—202036操作方法6.1定性分析6.1.1样品前处理6.1.1.1案件样品6.1.1.1.1体液样品取全血或尿液100μL，准确加入100ng/mL的内标工作溶液10μL，混合10s，加入硼砂缓冲溶液（pH9.2）100μL，乙酸乙酯0.7mL，涡旋30s，9700×g离心5min。取上层有机相置于5mL离心管中，40℃下吹干。加入流动相A200μL复溶，9700×g离心5min，取上清液100μL至进样瓶中，取上清液供仪器分析。6.1.1.1.2毛发样品应依次用适量的水和丙酮将毛发样品振荡洗涤两次，晾干后剪成约1mm段，称取毛发样品20mg于2mL研磨管中，加研磨珠适量，再加含1ng/mL内标的提取溶液1mL，液氮冷冻研磨，14000×g离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜，滤液直接供仪器分析。6.1.1.2质控样品6.1.1.2.1体液样品取空白全血（或尿液）100μL各两份，一份作为空白样品，一份添加10ng/mL的31种芬太尼类新精神活性物质的混标工作液10μL，配制成1ng/mL的添加样品，然后按照6.1.1.1.1方法，与案件样品平行操作。6.1.1.2.2毛发样品称取空白毛发样品20mg两份，一份作为空白样品，一份添加100ng/mL的31种芬太尼类新精神活性物质的混标工作液10μL，制得0.05ng/mg添加样品，然后按照6.1.1.1.2方法，与案件样品平行操作。6.1.2仪器检测6.1.2.1仪器条件6.1.2.1.1液相色谱条件液相色谱条件包括：a)色谱柱：AcquityTMUPLCHSST3（100mm×2.1mm，1.8μm）（或其他等效柱）；注：AcquityTMUPLCHSST3柱为美国waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：流动相A为20mmol/L乙酸铵缓冲溶液（含0.1%甲酸和5%乙腈），流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；c)流速：200L/min（或适宜流速）；d)柱温：室温；e)进样量：5µL。注：可根据不同仪器的实际情况进行液相色谱条件调整。SF/T0066—20204表1梯度洗脱程序时间min流动相A（%）流动相B（%）08515472285722810703013554513.559514.585151685156.1.2.1.2质谱条件质谱条件包括：a)离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；b)检测方式：多反应监测(MRM）；c)离子源电压(IS)：5500V；d)碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气(GS2)均为高纯氮气，使用前调节各气流流量以使质谱灵敏度达到检测要求；e)去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)应优化至最佳灵敏度。注：可根据不同仪器的实际情况进行质谱条件调整。在6.1.2.1.1和6.1.2.1.2的色谱和质谱条件下，31种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物和内标的定性离子对、定量离子对和保留时间见表2。31种目标物的MRM色谱图参见附录A。表231种芬太尼类新精神活性物质及其代谢物、内标的质谱参数和保留时间目标物母离子m/z碎片离子m/z去簇电压V碰撞能量eV保留时间min内标芬太尼337.2188.3a50358.51Fentanyl-D5CAS：437-38-7104.95051去甲基芬太尼233.184.0a40293.93Norfentanyl-D5CAS：33794-42-255.24044阿芬太尼417.3268.3a40257.87Fentanyl-D5CAS：71195-58-9197.14035乙酰芬太尼323.2188.1a50356.43Fentanyl-D5CAS：3258-84-2105.05050乙酰去甲基芬太尼219.384.0a30242.41Norfentanyl-D5CAS：22352-82-556.03040去丙烯酰芬太尼281.1188.1a45239.62Fentanyl-D5CAS：21409-26-7105.14540SF/T0066—20205表2（续）丙烯酰芬太尼335.51