SNT 2328-2009 化妆品急性毒性的角质细胞试验

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３２８—２００９化妆品急性毒性的角质细胞试验犆狅狊犿犲狋犻犮狊犪犮狌狋犲狋狅狓犻犮犻狋狔狅犳犽犲狉犪狋犻狀狅犮狔狋犲犮狔狋狅狋狅狓犻犮犻狋狔狋犲狊狋２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｄ是规范性附录，附录Ｃ是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３２８—２００９化妆品急性毒性的角质细胞试验１　范围本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测。本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于受试物质毒性的整体评价。本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定参考方法。２　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１希尔函数　犺犻犾犾犳狌狀犮狋犻狅狀关于受试物浓度与反应关系的包含４个变量的Ｓ型对数数学模型。犢＝Ｂｏｔｔｏｍ＋Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０－犡）ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ犢是反应，犡是剂量（或浓度）对数，Ｂｏｔｔｏｍ是最小反应，Ｔｏｐ是最大反应，ｌｏｇＩＣ５０是反应剂量或浓度在最高（Ｔｏｐ）和最低（Ｂｏｔｔｏｍ）中间时的对数，ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ表示曲线的倾斜度。２．２人角质细胞　犺狌犿犪狀犽犲狉犪狋犻狀狅犮狔狋犲，犎犓犆角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可合成角蛋白的细胞，体内呈分层生长排列；体外分离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。２．３２０％致死浓度犐犆２０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制２０％的受试物浓度。２．４半数致死浓度犐犆５０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制５０％的受试物浓度。２．５８０％致死浓度犐犆８０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制８０％的受试物浓度。３　基本原理本标准采用正常人角质细胞，应用中性红摄取（ＮＲＵ）细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外培养的正常哺乳动物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会干扰细胞的分裂增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红（ＮＲ）是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变，１犛犖／犜２３２８—２００９引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可逆。这些变化导致细胞吸收和连接ＮＲ的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞ＮＲＵ细胞毒性检测程序是基于这一原理设计的一种反映细胞存活／活力变化的检测方法。４　试验准备除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂家，如有证据证明，可以使用替代品。４．１　人角质细胞人角质细胞可用原代或细胞系：ａ）　人永生化角质细胞系ＨａＣａＴ：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）获取；ｂ）　正常人角质细胞（ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＮＨＫ）：商品化细胞系，可从美国ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ公司（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣＣ２５０７或ＣＣ２６０７）获取；ｃ）　原代人角质细胞（ＰｒｉｍａｒｙＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤，需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。４．２　细胞培养基４．２．１　人角质细胞无血清基础培养基商品化购置或实验室自行配制，可从美国ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ公司ＫＢＭ（ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ）或ＧＩＢＣＯ公司ＫＳＦＭ（ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳｅｒｕｍＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ）获取。４．２．２　人角质细胞培养基补充试剂配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（ＥＧＦ）、胰岛素（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、氢化可的松（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（ＢｏｖｉｎｅＰｉｔｕｉｔａｒｙＥｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）。配制上述各种成分的贮备液浓度如下：０．１ｎｇ／ｍＬｈＥＧＦ０．５ｍＬ；５．０ｍｇ／ｍＬ胰岛素０．５ｍＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ氢化可的松０．５ｍＬ；３０ｍｇ／ｍＬ庆大霉素、１５μｇ／ｍＬ两性霉素Ｂ０．５ｍＬ；７．５ｍｇ／ｍＬ牛垂体提取物２．０ｍＬ。上述补充试剂也可以由供应商提供试剂盒，如美国ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ公司（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＣＣ４１３１）。４．２．３　人角质细胞血清培养基建议用无血清培养基培养角质细胞：ａ）　角质细胞系（ＨａＣａＴ）血清培养基：９０ｍＬＭＥＭ基础培养基，１０ｍＬＦＣＳ、１ｍＬ非必需氨基酸、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素；ｂ）　ＮＨＫ和原代人角质细胞血清培养基：含１５％小牛血清的黄素腺嘌呤二核苷酸培养液（ＤＭＥＭ：Ｆ１２／３∶１），含有腺嘌呤（２４．３μｇ／ｍＬ），表皮生长因子（１０ｎｇ／ｍＬ），转铁蛋白（５μｇ／ｍＬ），氢化可的松（０．４μｇ／ｍＬ），胰岛素（１００Ｕ／ｍＬ），青霉素（１００Ｕ／ｍＬ），链霉素（１００μｇ／ｍＬ）。４．２．４　人角质细胞无血清完全培养基５００ｍＬ人角质细胞无血清基础培养基（ＫＢＭ或ＫＳＦＭ），添加以下成分：０．０００１ｎｇ／ｍＬ人重组ＥＧＦ，５μｇ／ｍＬ胰岛素，０．５μｇ／ｍＬ氢化可的松，３０μｇ／ｍＬ庆大霉素，１５ｎｇ／ｍＬ两性霉素，３０μｇ／ｍＬ牛垂体提取物。添加１６５μＬ氯化钙溶液，钙终浓度为０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ。完全培养基保存在２℃～８℃，不超过２周。４．２．５　人角质细胞冻存培养基ＭＥＭ基础培养基，含２０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍＬ青霉素、５０μｇ／ｍＬ链霉素、１０％ＤＭＳＯ。４．３　细胞培养试剂４．３．１　胎牛血清（ＦＣＳ）：国产优质或进口，５６℃加热灭活３０ｍｉｎ。４．３．２　小牛血清：国产优质或进口。２犛犖／犜２３２８—２００９４．３．３　裂解酶（ＤｉｓｐａｓｅⅡ）：用于原代人角质细胞分离培养。４．３．４　０．２５％胰酶／ＥＤＴＡ溶液；０．２５％胰酶溶液与０．０２ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液１∶１混匀。４．３．５　胰酶中和液（ＴｒｙｐｓｉｎＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ，ＴＮＳ）。４．３．６　青霉素／链霉素双抗（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）：青霉素（１００Ｕ／ｍＬ），链霉素（１００μｇ／ｍＬ）。４．３．７　二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）：用于细胞冻存。４．３．８　ＨＥＰＥＳ缓冲盐溶液（ＨＥＰＥＳＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＥＰＥＳＢＳＳ）。４．３．９　阳性物质：十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），或称月桂基硫酸钠（ＳＬＳ）。４．３．１０　磷酸盐缓冲液（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）。４．３．１１　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ氏磷酸盐缓冲液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ，ＤＰＢＳ）：含钙镁阳离子，葡萄糖随意，用于冲洗。４．３．１２　中性红染料（ＮＲ）：组织培养基，液体或粉剂均可。４．３．１３　乙醇：无水乙醇用于受试物制备，９５％乙醇用于配制解析液。４．３．１４　冰乙酸：分析纯。４．３．１５　无Ｃａ２＋或Ｍｇ２＋Ｈａｎｋｓ’平衡盐溶液（ＣＭＦＨＢＳＳ）。４．３．１６　氯化钙贮备液：制备０．３Ｍ贮备液，高压灭菌备用。４．３．１７　超纯水。４．４　中性红溶液４．４．１　中性红贮备液首选商品化的液态ＮＲ贮存液，如ＳＩＧＭＡ公司的组织培养基ＮＲ贮备液（Ｎ２８８９），浓度为３．３ｍｇ／ｍＬ。也可由干粉制备ＮＲ贮备液：０．３３ｇＮＲ干粉溶于１００ｍＬ纯水，贮备液应先置于暗处，室温放置２个月。４．４．２　中性红培养液１．０ｍＬ中性红贮备液与预温至３７℃的９９．０ｍＬ完全培养液混合，中性红的终浓度为３３μｇ／ｍＬ，使用当天配制。ＮＲ培养液应用０．２μｍ～０．４５μｍ的滤膜进行过滤以减少中性红结晶，中性红培养液在加入细胞前应在３７℃水浴中温育，在制备后３０ｍｉｎ内使用，或在离开３７℃水浴后１５ｍｉｎ内使用。４．４．３　中性红解析液（乙醇／醋酸液）按体积比配制中性红解析液，含１％冰乙酸、５０％乙醇和４９％水。４．５　受试物制备见附录Ａ。４．６　耗材４．６．１　组织培养瓶：２５ｃｍ２和７５ｃｍ２，用于常规培养。４．６．２　培养皿：６０ｍｍ×１５ｍｍ，用于细胞常规培养。４．６．３　９６孔平底组织培养微孔板。４．６．４　２ｍＬ细胞冻存管。４．６．５　０．２μｍ微孔滤膜。４．６．６　带盖无菌玻璃试管（５ｍＬ，１０ｍＬ）。４．６．７　ｐＨ试纸。４．６．８　移液管和吸头。４．６．９　封板膜。４．７　仪器和设备４．７．１　培养箱：温度３７℃±１℃，湿度９０％±５％，５％±１％ＣＯ２。３犛犖／犜２３２８—２００９４．７．２　层流洁净柜（生物安全标准）或生物安全柜。４．７．３　恒温水浴箱：温度３７℃±１℃。４．７．４　倒置相差显微镜。４．７．５　电子天平。４．７．６　９６孔板分光光度计（酶标仪）：配５４０ｎｍ±１０ｎｍ滤光片。４．７．７　移液器：单通道或多通道移液器，用于吸取细胞、洗板溶液、ＮＲ培养基和解析液等操作，不可用于吸取受试物。４．７．８　微孔板摇床。４．７．９　细胞计数仪或血球计数器。４．７．１０　离心机（最好配有微孔板转子）。４．７．１１　水浴超声波破碎仪。４．７．１２　磁力搅拌器。４．７．１３　旋涡混合器。４．７．１４　过滤器／过滤装置。４．７．１５　抗静电离子发生器／消磁枪：用于中和９６孔板静电。５　试验过程５．１　基本要求除ＮＲ贮备液外的所有溶液、玻璃器皿、吸头等都应无菌，所有操作应在无菌条件和无菌环境下进行。角质细胞毒性试验流程见附录Ｂ。５．２　试验前考虑因素５．２．１　对于在试验条件下具有挥发性的受试物，ＩＣ５０的变化可能比较大，尤其当化合物的毒性非常低时，可以采用能透过ＣＯ２但不能透过挥发性受试物的塑料薄膜封闭培养盖加以解决。５．２．２　难溶解于无血清培养基的物质可能不易测试，其体内毒性潜力可能被低估。５．２．３　水中不稳定或发生爆炸的受试物不能用于试验。５．２．４　特异性的攻击处于分裂中细胞的物质，其体内毒性可能被高估。５．２．５　受试物对细胞内溶酶体具有选择性作用时，可能会出现细胞活性读数偏低的情况。如硫酸氯喹，它能改变溶酶体的ｐＨ值，产生抑制ＮＲＵ的作用。５．２．６　除非在经过冲洗后细胞内仍残留有足够量的该种受试物，并能溶解于中性红溶液中，否则红色的受试物在中性红所在的波长范围内产生吸收作用，可能干扰试验结果。５．３　角质细胞的培养５．３．１　角质细胞培养及冻存参见附录Ｃ。５．３．２　角质细胞的无血清培养用于毒性检测的角质细胞最好一直用无血清培养基培养，含血清培养的细胞用于检测前应改为无血清培养，注意培养基的转换应逐步进行，并记录细胞在转换培养基中形态的变化。无血清培养的角质细胞在组织培养瓶中常规生长成单层，在温度３７℃±１℃、湿度９０％±５％和ＣＯ２浓度５．０％±１％条件下培养，每天相差显微镜观察细胞，记录细胞形态学的改变或细胞粘附特性。５．４　角质细胞的制备５．４．１　９６孔细胞板的分布本试验方法采用９６孔板，其结构如图１。４犛犖／犜２３２８—２００９ＶＣ１和ＶＣ２———溶剂对照（无受试物，有细胞）；Ｃ１～Ｃ８———８个浓度的受试物（Ｃ１：最高浓度，Ｃ８：最低浓度）；Ｃ１ｂ～Ｃ８ｂ———８