GB∕T 15981-2021 消毒器械灭菌效果评价方法

书书书犐犆犛１１．０８０犆犆犛犆５９中华人民共和国国家标准犌犅／犜１５９８１—２０２１代替犌犅１５９８１—１９９５消毒器械灭菌效果评价方法犈狏犪犾狌犪狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犲犳犳犻犮犪犮狔狅犳狊狋犲狉犻犾犻狕犪狋犻狅狀犳狅狉犱犻狊犻狀犳犲犮狋犻狅狀犲狇狌犻狆犿犲狀狋２０２１１２３１发布２０２２０７０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前　　言　　本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则　第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替ＧＢ１５９８１—１９９５《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》，与ＧＢ１５９８１—１９９５相比，主要技术变化如下：———修改了适用范围（见第１章，１９９５年版的第１章）；———增加了“术语和定义”一章（见第３章）；———删除了试剂（见１９９５年版的第２章）；———删除了指示菌（见１９９５年版的第３章）；———删除了化学指示剂（见１９９５年版的第４章）；———删除了技术要求（见１９９５年版的第５章）；———修改了压力蒸汽灭菌效果检测方法的内容，改为“试验步骤”（见４．１．２，１９９５年版的第６章）；———删除了第二篇的内容（见１９９５年版的第８章～第１２章）；———删除了第三篇的内容（见１９９５年版的第１３章～第１７章）；———增加了消毒器械灭菌效果鉴定试验（见第４章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国国家卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国人民解放军疾病预防控制中心、江苏省疾病预防控制中心、山东省疾病预防控制中心、河南省疾病预防控制中心、江西省卫生健康监测评价中心。本文件主要起草人：张流波、李涛、王妍彦、赵斌秀、李新武、姚楚水、徐燕、崔树玉、沈瑾、张剑、刘吉起、周玉。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：———１９９５年首次发布为ＧＢ１５９８１—１９９５；———本次为第一次修订。Ⅰ犌犅／犜１５９８１—２０２１消毒器械灭菌效果评价方法１　范围本文件规定了压力蒸汽灭菌器、干热灭菌器（柜）、环氧乙烷灭菌器、低温蒸汽甲醛灭菌器、过氧化氢气体等离子体灭菌器灭菌效果鉴定试验的试验器材、试验步骤、评价规定以及注意事项。本文件适用于压力蒸汽灭菌器、干热灭菌器（柜）、环氧乙烷灭菌器、低温蒸汽甲醛灭菌器、过氧化氢气体等离子体灭菌器灭菌效果的评价。２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢＺ２．１　工作场所有害因素职业接触限值　第１部分：化学有害因素ＷＳ／Ｔ６４９　医用低温蒸汽甲醛灭菌器卫生要求ＷＳ／Ｔ６８３　消毒试验用微生物要求３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１犇值　犇狏犪犾狌犲在设定的暴露条件下，杀灭特定试验微生物总数的９０％所需的时间。３．２载体　犮犪狉狉犻犲狉试验微生物的支持物。３．３满载　犳狌犾犾狔犾狅犪犱犲犱消毒器械使用时，按厂家说明书规定方式摆放的最大允许装载量。３．４灭菌过程挑战装置　狆狉狅犮犲狊狊犮犺犪犾犾犲狀犵犲犱犲狏犻犮犲；犘犆犇专门设计的模拟被灭菌物品，对特定灭菌过程有抗力，用于评价该灭菌过程有效性的装置。４　消毒器械灭菌效果鉴定试验４．１　压力蒸汽灭菌器灭菌效果鉴定试验４．１．１　试验器材４．１．１．１　试验菌片：嗜热脂肪杆菌芽孢（ＡＴＣＣ７９５３或ＳＳＩＫ３１株）菌片（布片或滤纸片），回收菌１犌犅／犜１５９８１—２０２１量≥１×１０５ＣＦＵ／片，在１２１℃±０．５℃条件下，Ｄ值≥１．５ｍｉｎ；也可采用符合上述要求的自含式生物指示物。４．１．１．２　标准生物测试包：２３ｃｍ×２３ｃｍ×１５ｃｍ的普通棉布包（每１０ｍｍ经线数３０±６、纬线数２７±５），质量１．５ｋｇ±０．０４５ｋｇ。４．１．１．３　通气贮物盒：体积为２２ｃｍ×１３ｃｍ×６ｃｍ。４．１．１．４　满载物品：使用说明书中规定的物品。４．１．１．５　试剂：磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，见附录Ａ的Ａ．１）；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ，见Ａ．３）；溴甲酚紫蛋白胨培养液（见Ａ．４）。４．１．２　试验步骤试验步骤如下。ａ）　将两个菌片装入灭菌小纸袋内（也可直接用生物指示物）。ｂ）　将装好菌片的纸袋或两个嗜热脂肪杆菌芽孢（ＡＴＣＣ７９５３或ＳＳＩＫ３１株）的自含式生物指示物置于标准测试包中心部位，制成标准生物测试包（也可使用符合４．１．１．１要求的一次性标准生物测试包）。ｃ）　对下排气压力蒸汽灭菌器，于灭菌器每层中间、排气口和近灭菌器门处各放置一个生物测试包；对预真空式压力蒸汽灭菌器，在灭菌器内每层各放置一个标准测试包；对器室容积较小，不能放入标准测试包的压力蒸汽灭菌器，用通气贮物盒代替标准测试包，盒内盛满试管，指示菌片或生物指示物放于中心部位的两支灭菌试管内（试管口用灭菌牛皮纸包封），将贮物盒平放于压力蒸汽灭菌器底部。ｄ）　装入满载物品，满载运行１个灭菌周期。灭菌周期结束后，取出指示菌片，投入含５．０ｍＬ溴甲酚紫蛋白胨培养液的试管中，或取出生物指示物，经５６℃±２℃培养７ｄ（生物指示物的培养方法按说明书执行），观察培养基颜色变化。检测时以培养基作为阴性对照，以加入指示菌片的培养基作为阳性对照。另取两片试验菌片进行回收菌量测定。生物指示物的阴性对照和阳性对照的设置方法按说明书操作。ｅ）　试验重复５次。４．１．３　评价规定４．１．３．１　判定灭菌器灭菌效果合格需同时满足：每次试验阳性对照培养基颜色变黄；阴性对照培养基颜色不变；对照菌片的回收菌量≥１×１０５ＣＦＵ／片；试验组颜色不变。４．１．３．２　用自含式生物指示物进行评价时，结果判定按说明书进行。４．１．４　注意事项４．１．４．１　所用菌片和灭菌生物指示物应在有效期内。４．１．４．２　严格遵守无菌操作技术规定。４．１．４．３　试验应在满载条件下进行。４．１．４．４　严格遵守压力容器操作规程。４．１．４．５　若压力蒸汽灭菌器有多种灭菌程序，则每一种灭菌程序均应分别验证。４．２　干热灭菌器（柜）灭菌效果鉴定试验４．２．１　试验器材４．２．１．１　试验菌片：实验室自用的枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和芽孢菌片按ＷＳ／Ｔ６８３方法制备，菌片２犌犅／犜１５９８１—２０２１回收菌量为≥１×１０６ＣＦＵ／片，在温度为１６０℃±２℃的条件下，Ｄ值≥２．５ｍｉｎ。也可采用符合上述要求的自含式生物指示物。染菌载体为直径１２ｍｍ不锈钢片，或面积为１０ｍｍ×１０ｍｍ玻片，必要时增用或改用其他载体。４．２．１．２　试剂：磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，见Ａ．１）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ，见Ａ．２）；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ，见Ａ．３）。４．２．１．３　满载物品：使用说明书中规定的物品。４．２．２　试验步骤试验步骤如下。ａ）　每次试验取２个菌片为一组，平放于无菌平皿内，勿重叠。加盖，分别放于灭菌器（柜）内各层，对角线的内、中、外３点，相邻层对角线交叉摆放。在柜内摆放物品至满载。ｂ）　关闭器（柜）门，开启电源，按灭菌器（柜）设计程序时间运行１个周期进行灭菌。灭菌完毕，待灭菌器温度自然下降至５０℃以下，方可打开柜门。取出平皿，将菌片取出接种于含５．０ｍＬＴＳＢ试管中，置３６℃±１℃恒温培养箱内培养７ｄ，自第３日起每日观察结果，混浊表面有皱褶状菌膜者表示有菌生长，判定为阳性；澄清者表示无菌生长，判定为阴性。对难以判定的肉汤管，取其中０．１ｍＬ～０．２ｍＬ悬液接种ＴＳＡ平板，用灭菌Ｌ棒涂布均匀，置３６℃±１℃恒温培养箱中培养。４８ｈ后涂片染色，在显微镜下观察菌落形态，或进一步参照相关标准做其他试验，以判断生长者是否为试验菌。若有非试验菌污染，应查找原因重新进行试验。ｃ）　菌数对照组，以同批试验用菌片２片放在室温下，待试验组灭菌接种后，立即分别移入含５．０ｍＬＰＢＳ试管中，振打８０次，按ＷＳ／Ｔ６８３所示方法进行活菌培养计数。ｄ）　阳性对照组，以同批试验用菌片２片放在室温下，待试验组灭菌接种后，立即分别移入含５．０ｍＬＴＳＢ试管中，放入培养箱中培养７ｄ，自第３日起每日与试验组同时观察结果。ｅ）　阴性对照组，以未染菌载体２片分别接种于５．０ｍＬＴＳＢ，放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长。ｆ）　试验重复５次。４．２．３　评价规定４．２．３．１　判定灭菌器灭菌效果合格需同时满足：在５次灭菌试验中，各次试验菌数对照组的回收菌量≥１×１０６ＣＦＵ／片；阳性对照组有菌生长；阴性对照组无菌生长；所有试验菌片均无菌生长。４．２．３．２　用自含式生物指示物进行评价时，结果判定按说明书进行。４．２．４　注意事项４．２．４．１　严格遵守无菌操作技术规定。４．２．４．２　试验应在满载条件下进行。４．３　环氧乙烷灭菌器灭菌效果鉴定试验４．３．１　试验器材４．３．１．１　试验菌片：枯草杆菌黑色变种（ＡＴＣＣ９３７２）芽孢或其生物指示物。在环氧乙烷浓度为６００ｍｇ／Ｌ±３０ｍｇ／Ｌ，温度５４℃±１℃，相对湿度６０％±１０％时，Ｄ值≥２．５ｍｉｎ（使用环氧乙烷混合气体）或Ｄ值≥２．０ｍｉｎ（使用１００％环氧乙烷纯气体）。染菌载体为滤纸片，面积为１０ｍｍ×１０ｍｍ，必要时增用或改用其他载体，菌片回收菌量应≥１×１０６ＣＦＵ／片。也可采用符合上述要求的自含式生物指示物。３犌犅／犜１５９８１—２０２１４．３．１．２　聚乙烯塑料袋：大小为６０ｍｍ×４０ｍｍ，材料厚度为０．１５ｍｍ～０．２５ｍｍ。４．３．１．３　试剂：磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，见Ａ．１）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ，见Ａ．２）；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ，见Ａ．３）。４．３．１．４　满载物品：使用说明书中规定的物品。４．３．２　试验步骤试验步骤如下。ａ）　按ＷＳ／Ｔ６８３方法制备枯草杆菌黑色变种芽孢悬液和菌片。菌片放入聚乙烯塑料袋内密封包装，每袋２片（也可直接使用自含式生物指示物）。每次试验需用菌片数量应依据灭菌柜室可用体积大小确定：当体积≤５ｍ３时，用１０袋（２０个菌片）；当５ｍ３＜体积≤１０ｍ３时，每增加１ｍ３，应增加１袋菌片（１０袋～１５袋）；当体积＞１０ｍ３时，每增加２ｍ３，应增加１袋菌片（≥１５袋）。ｂ）　将装有菌片的聚乙烯塑料袋或生物指示物先放置于被灭菌物品中，然后再放入灭菌柜。放置点的选择首先应考虑最难灭菌位置（可根据产品设计参数或者温湿度监测数据，如靠近器室不受热的位置或器门处等），其余再均匀分布于灭菌器室中。ｃ）　按使用说明书所规定的环氧乙烷浓度、１个灭菌周期作用时间、柜内的温度和相对湿度，在满载条件下进行环氧乙烷灭菌处理。ｄ）　灭菌完毕，取出菌片，分别置于含５ｍＬＴＳＢ的试管中（自含式生物指示物按说明书要求操作），置３６℃±１℃恒温培养箱内培养７ｄ，自第３日起每日观察结果，混浊表面有皱褶状菌膜者表示有菌生长，判定为阳性；澄清者表示无菌生长，判定为阴性。或取出生物指示物，经３６℃±１℃培养７ｄ（生物指示物的培养方法按说明书执行），作为试验组。ｅ）　以同批试验用菌片２片放在室温下，待试验组完成灭菌程序后，立即分别移入含５．０ｍＬ０．５％吐温８０ＰＢＳ的试管中，振打８０次，按ＷＳ／Ｔ６８３所示方法进行活菌培养计数，作为回收菌量对照组。ｆ）　以同批试验用菌片２片放在室温下，待试验组完成灭菌程序后，立即分别置于含５．０ｍＬＴＳＢ试管中，放入３６℃±１℃培养箱中培养７ｄ，自第３日起每日与试验组同时观察结果，作为阳性对照组。ｇ）　以未染菌载体２片分别置于含５．０ｍＬＴＳＢ试管中，放入培养箱中作定性培养，观察有无细菌生长，作为阴性对照组。ｈ）　试验重复５次。４．３．３　评价规定４．３．３．１　判定灭菌器灭菌效果合格需同时满足：每次试验菌数对照组的回收菌量应≥１×１０６ＣＦＵ／片；阳性对照组有菌生长；阴性对照组无菌生长；所有试验组菌片均无菌生长。４．３．３．２　对难以判断结果的ＴＳＢ，取其中０．１ｍＬ～０．２ｍＬ悬液接种ＴＳＡ平板