SN∕T 5474-2022 非人源样本中新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 的检测技术规范

ICS11.220CCSB41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5474—2022非人源样本中新型冠状病毒（SARS-CoV-2)的检测技术规范Protocolfordetectionofnovelcoronavirus(SARS-CoV-2)innonhumansourcesamples2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布SN/T5474—2022I前言本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国武汉海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国南京海关、上海速芯生物科技有限公司、宁波爱基因科技有限公司。本文件主要起草人：陈孝宇、薛俊欣、郑剑、方雪恩、林华、姜焱、陈建军、陈鑫、周旋、卢先东、孔继烈、刘艳红、张强、申进玲、李季。SN/T5474—20221非人源样本中新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测技术规范1范围本文件规定了动物、物品、环境和水体等非人源样本的采集，以及样本中新型冠状病毒核酸的检测方法，包括实时荧光RT-PCR法和RT-RPA法，以及RT-LAMP微流控芯片现场快速检测方法。本文件适用于非人源样本的新型冠状病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求卫办医政发〔2010〕194号医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法国卫办科教函〔2020〕70号新型冠状病毒实验室生物安全指南联防联控机制医疗发〔2020〕271号医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1非人源样本源自动物、物品、环境和水体等采集的样本。3.1.2重组酶聚合酶扩增技术recombinasepolymeraseamplification，RPA重组酶聚合酶扩增技术是一种通过重组酶介导链置换，可对模板上靶序列区域进行指数扩增的等温核酸扩增技术。3.1.3环介导等温扩增技术loop-mediatedisothermalamplification，LAMP环介导等温扩增技术是一种依赖于识别靶序列的特异性片段的引物和链置换DNA聚合酶的等温核酸扩增技术。3.1.4微流控microfluidics微流控是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术，是涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。3.1.5SN/T5474—20222微流控芯片技术microfluidicchiptechnology把生物、化学、医学分析过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺寸的芯片上，自动完成分析全过程的技术。3.1.6Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.1.7Tt值timethreshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）。RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）。PEG：聚乙二醇（polyethyleneglycol）。PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline）。4原理针对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）保守基因序列设计引物及探针，采用实时荧光RT-PCR、RT-RPA和RT-LAMP等方法进行反转录与扩增。若样本中含有目的片段而得到扩增，可产生荧光信号被检测器实时捕获，通过荧光信号的产生来判断样本中是否含有SARS-CoV-2核酸。恒等温核酸检测方法与微流控芯片法的联合使用，将引物固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装。将提取的核酸模板与反应液混合后，加入封装好的微流控芯片中，放入带有离心和恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔中进行恒温扩增。若样本中含有目的基因片段而得到扩增，根据其产生荧光信号的时间、强度和位置，判断样本中是否含有SARS-CoV-2核酸。5生物安全要求5.1实验室设备、设施及废弃物处理等要求应符合GB19489的规定。5.2实验室管理和人员要求5.2.1实验室管理要求开展核酸检测的实验室，应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》有关规定，具备经过卫生健康行政部门审核备案的生物安全二级及以上实验室条件，以及临床基因扩增检验实验室条件。新型冠状病毒样本运输和实验室检测流程应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》和《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》的相关要求。5.2.2样本采集人员要求SN/T5474—20223样本采集人员应当经过生物安全培训并合格，熟悉样本采集方法，熟练掌握样本采集操作流程。应严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息记录，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。采样人员防护装备要求：N95及以上防护口罩、护目镜、防护服、乳胶手套、防水靴套；如果接触血液、体液、分泌物或排泄物，戴双层乳胶手套；手套被污染时，及时更换外层乳胶手套。每采一个样本应当进行严格手消毒或更换手套。5.2.3样本检测人员要求实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。检测人员应采用生物安全三级实验室的个人防护。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无RNase污染的容器分装。相关溶液配制参照附录A。6.140mL甘氨酸缓冲液。6.25×PEG/NaCl溶液。6.3磷酸盐缓冲液(PBS)。6.4Trizol。6.5三氯甲烷。6.6异丙醇。6.775%乙醇。6.8磁珠法提取试剂。6.9硫代硫酸钠。6.10实时荧光RT-PCRORF1ab基因引物和探针：上游引物OF：5-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’；下游引物OR：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’；探针OP：FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1。N基因引物和探针：上游引物NF：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；下游引物NR：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’；探针NP：FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1。6.11实时荧光RT-RPAORF1ab基因引物和探针：上游引物ROF：5’-TGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCA-3’；下游引物ROR：5’-CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGACG-3’；探针ROP：TGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAA[FAM-dT]A[THF]C[BHQ1-dT]ACAACTTGTGCTA-C3spacer。6.12实时荧光RT-LAMPORF1ab基因引物：外侧上游引物OF3：5’-GAGCCATGCCTAAYATGC-3’；SN/T5474—20224外侧下游引物OB3：5’-CTCCTGATGAGGTTCCAC-3’;内侧上游引物OFIP：5’-CGGTGTGACAAGCTACAACACGAATTATGGCCTCACTTGTTC-3’；内侧下游引物OBIP：5’-GATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTTTTAACATATAGTGAACCGCC-3’。N基因引物：外侧上游引物NF3：5’-YGGTGCTAACAAAGAMGGC-3’；外侧下游引物NB3：5’-TACTGCTGCCWGGAGTTGAR-3’;内侧上游引物NFIP：5’-GCATTGTTAGCAGGATTGCGGGGTTGCAACTGAGGGAGCC-3’；内侧下游引物NBIP：5’-TCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGGTTGCGACTACGTGATGAGG-3’。6.13孔径0.45μm的带正电尼龙膜（positivechargednylonmembrane,NL+）。6.14默克millipore公司最大载量为15mL且分子量为100kDa的50mL超滤管或其他等效产品。6.15微流控芯片：5µL/反应池，8×4规格离心微流控芯片。微流控芯片制作与质量控制见附录B。6.16PCR反应管。6.17均质袋。7仪器设备7.1实时荧光PCR仪。7.2恒温荧光检测仪。7.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.4恒温水浴锅。7.5离心机：转速大于等于12000r/min。7.6微量移液器：量程0.5µL~10µL、10µL~100µL、20µL~200µL、200µL~1000µL。7.7研钵及粉碎装置。7.8涡旋振荡器。7.9离心管：2mL、1.5mL。7.10生物安全柜。7.11消毒灭菌锅。7.12恒温振荡摇床高速离心机：可装15mL、50mL离心管，转速达12000g。7.13低温冰箱7.14冷藏冷冻冰箱7.15纯水器或双蒸水器。7.16旋涡振荡器。7.17抽滤机。7.18纯水仪。7.19恒温干燥箱。7.20干式恒温仪。7.21全自动磁珠法核酸提取仪。7.22微流控芯片检测仪：技术规格要求参见附录C。8样本采集、处理及核酸制备试验8.1样品采集和处理SN/T5474—202258.1.1动物样本的采集8.1.1.1鼻腔分泌物样品的采集以保存液润湿拭子，撩拭鼻腔收集分泌物完成采样。动物出现病毒感染症状时应使用长型鼻腔采样器进行采样。鼻腔拭子样品的采集，将棉拭子一端充分插入鼻腔，旋转后沾上分泌液，将样品端置于含有抗生素PBS的（加0.8mL~1.0mLPBS）无菌试管中，剪下或折断，盖上管盖，用防水记号笔作好标记。8.1.1.2排泄物样品的采集从动物的直肠或泄殖腔采集新鲜排泄物，直接置于灭菌容器中。也可以用棉拭子从直肠或泄殖腔擦拭采集后放入含磷酸盐缓冲液的灭菌容器中。8.1.1.3眼部分泌物样品的采集提起眼睑，用棉拭子在其表面轻轻刮拭采集眼部分泌物样品。8.1.1.4血液样品的采集采血前用75%酒精棉球消毒采血部位后施行采血。采血部位、采血方法及采血量依据动物种类、品种、个体大小等不同情况和具体的检测要求而定。8.1.2环境、外包装或物体表面样本的采集环境、外包装或物体表面拭子样本的采集。每个集装箱按前后、上下、左右均匀选择10个点位区域，采集点位区域内冷链食品外包装箱表面涂抹样本，点位区域所采样的冷链食品箱应做好标记，采样后相对集中堆放。每个点位区域作为1件样本，按照多点分布式采样，至少选择5个涂抹点，每个涂抹点面积不小于5cm×5cm。同一集装箱内货物如有不同品类或不同批次，优先覆盖不同品类，并按构成比例覆盖相应批次。现场采样由两名及以上的工作人员参与完成。采样时应记录采样时间、地点、点位信息、食品产地、食品名称、批次号、样本编号以及采样人等信息。具体采样方法为将无菌棉拭子使用PBS湿润后，用力擦拭表面，将棉拭子浸入约含1mL无菌PBS的试管中，紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3-4次，确保挤压出最大量的病毒，测定并记录液体毫升数，用于后续RNA提取。硬质食品表面过于粗糙，可能会损坏棉拭子，可使用多个棉拭子。8.1.3肉类样本中病毒的处理称取25g肉类样品于带滤网的均质袋中，