WWT 0036-2012 田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范

A16备案号：37260-2012WW中华人民共和国文物保护行业标准WW/T0036—2012田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范TechnicalspecificationforDNAextractionfromarchaeologicalhumanremains（报批稿）2012-07-31发布中华人民共和国国家文物局发布2012-08-01实施中华人民共和国文物保护行业标准田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范TechnicalspecificationforDNAextractionfromarchaeologicalhumanremainsWW/T0036—2012*中华人民共和国国家文物局主编文物出版社出版发行（北京市东城区东直门内北小街2号楼）@wenwu.com北京达利天成印刷公司印刷新华书店经销*开本：880毫米×1230毫米1/16印张：12012年12月第1版2012年12月第1次印刷统一书号：115010·1802定价：10.00元目次WW/T0036—2012前言Ⅲ1范围12术语和定义13样本采集、运输和保存13.1样本采集13.2样本运输23.3样本保存24样本评估25DNA提取35.1基本要求35.2古DNA实验室基本设置35.3样本处理35.4DNA提取原理45.5硅粒法45.6硅离心柱法a55.7硅离心柱法b65.8DNA提取液质量鉴定76真实性验证86.1实验室内部真实性验证86.2克隆测序86.3其他实验室重复验证8附录A（规范性附录）样本采集记录格式9附录B（规范性附录）样本保存现状记录格式10附录C（资料性附录）样本检测记录格式11参考文献12IWW/T0036—2012II前言本标准依据GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国国家文物局提出。本标准由全国文物保护标准化技术委员会（SAC/TC289）归口。本标准负责起草单位：吉林大学。本标准主要起草人：周慧、朱泓、蔡大伟、张全超、崔银秋、许月。WW/T0036—2012IIIWW/T0036—2012IV1范围田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范WW/T0036—2012本标准规定了田野考古出土人类遗骸DNA获取的基本操作技术及要求。本标准适用于田野考古出土人类遗骸DNA的获取。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1脱氧核糖核酸DNAdeoxyribonucleicacid由脱氧核糖核苷酸构成的高分子聚合物。互补的双链呈双螺旋形，它是绝大多数生物的遗传物质。2.2聚合酶链反应PCRpolymerasechainreaction一种体外扩增DNA的方法，可在混合的DNA中特异地扩增靶序列。2.3外源DNAexogenousDNA样本之外的DNA，例如考古发掘者、样本采集者、样本研究者以及DNA提取相关实验人员的DNA。3样本采集、运输和保存3.1样本采集3.1.1采集工具骨骼样本采集工具：毛刷、小型电锯、小型电钻等。牙齿样本采集工具：毛刷、拔牙钳、牙钻等。软组织样本采集工具：手术刀、医用剪刀、镊子等。3.1.2基本要求在考古发掘过程中，对需要进行采集的样本，应减少人员直接接触，并避免阳光直射或雨淋，尤其是不能用水清洗。对于特别潮湿的样本，应先置于阴凉处晾干。采集者应戴一次性无菌的头套、口罩、手套，使用无菌采集工具。为了避免样本间的交叉污染，每采集完一个样本后，均需更换新的无菌采集工具。对于不便更换的采集工具应用5%次氯酸溶液清洗干净后再使用。对于接触样本的人员，宜用口腔拭子采集口腔黏膜细胞，或拔取数根带有毛囊的头发，以备后续的真实性验证。3.1.3采集方法3.1.3.1骨骼宜选择表面完整无破损且光滑致密的样本，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签（见图1）。对于特别珍贵的样本，可在骨骼局部位置用小型电锯切下一小块骨片（约2g），或用小型电钻钻取适量骨粉（约2g）。切割骨片或者钻取骨粉前，应先用毛刷清理骨骼表面的泥土或其他沉积物，并1WW/T0036—2012用5%次氯酸溶液擦拭骨骼表面，以除去骨骼表面的外源DNA污染。样本标签出土遗址：出土编号：采集时间：采集者：备注：年月日3.1.3.2牙齿图1样本标签用拔牙钳将牙齿从上颌骨或下颌骨中拔出，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签。对于特别珍贵的样本，可用牙钻在牙根部分钻取适量牙粉。钻取牙粉前，应先将牙齿置于5%次氯酸中浸泡15min，以除去牙齿表面的外源DNA污染。3.1.3.3软组织采集毛发样本时，如果有毛囊应连同毛囊一起拔取数根，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签。采集肌肉、皮肤以及脑和内脏等器官样本时，应用手术刀切取或医用剪子剪取部分样本，用镊子夹取放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签。3.1.4采集记录填写样本采集表，见附录A中的表A.1。3.2样本运输样本装箱时宜用泡沫塑料分隔固定，以避免在运输过程中样本颠簸受损。样本运输时，宜采用冷冻或冷藏运输方式。3.3样本保存样本入库时，样本库管理者应立即对样本进行照相，并保存电子文档和纸质文档。样本库管理者填写样本保存现状表，参见附录B中的表B.1。骨骼和牙齿等硬组织样本宜置于-20℃、软组织样本宜置于-80℃冰箱中保存。4样本评估实验前，研究人员要从多方面评估样本，以确定样本是否适合用于DNA提取,包括以下方面：a）样本的埋藏情况，包括有无墓室/棺椁、土壤特性、酸碱度、湿度等；b）样本的保存现状，包括入库时间，保存温度、湿度等；2c）样本的外观形态特征，包括样本的质地、颜色、表面风化及破损情况等；WW/T0036—2012d）样本的保存状态测试评估，宜对样本进行DNA定量、天冬氨酸（Asp）外消旋反应速率、骨质结构及成分分析等检测分析，参见附录C中的表C.1。5DNA提取5.1基本要求DNA提取的基本要求如下：a）所有实验操作均应在专门的古DNA实验室中完成；b）实验操作者应穿着无菌的实验服，戴一次性无菌头套、口罩和手套；c）在实验中应使用不含外源DNA的实验试剂；d）在实验中应使用一次性实验耗材，并经过高压蒸汽灭菌（0.1MPa，121℃，20min）；e）在实验中需多次重复使用的器具，应先进行超声清洗，接着用5%次氯酸溶液浸泡15min，最后高压蒸汽灭菌；f）在进行实验前，应用5%次氯酸溶液擦拭超净操作台，并紫外线照射30min；g）在进行样本处理时，每处理完一个样本，应及时更换新的无菌牙钻钻头或电锯锯片；h）在进行实验过程中应设置空白对照，用来监测实验过程中的外源DNA污染。5.2古DNA实验室基本设置5.2.1古DNA实验室功能分区及仪器设备如下：——样本处理区：牙钻、小型电锯、冷冻研磨机、超净工作台等；——DNA提取区：恒温摇床、高速冷冻离心机、超净工作台、微量移液器等；——PCR加样区：小型高速离心机、冰箱、超净工作台、微量移液器等；——PCR扩增区：PCR仪；——DNA检测区：凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计、天平、冰箱、微波炉、微量移液器等。5.2.2样本处理区、DNA提取区和PCR加样区应配备独立的空气过滤系统。5.2.3DNA检测区应设在与其他工作区不同的楼层或不同的建筑物里面，以避免PCR扩增产物对其他工作区的污染。5.2.4实验室应配备带紫外灯和正压气流的超净工作台。5.3样本处理5.3.1骨骼的处理首先用毛刷清理骨骼表面的泥土或其他沉积物，并用5%次氯酸溶液擦拭骨骼表面，以除去骨骼表面的外源DNA。接着用电锯切下一小片骨片（约2g），用牙钻钻头打磨骨片表面（重复3遍，约打磨掉1mm～2mm厚），进一步除去骨表面的污垢和杂质。将打磨好的骨片置于5%次氯酸溶液中浸泡15min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，紫外线照射30min，晾干。最后将骨片放入冷冻研磨机中，液氮冷却，打磨成骨粉，分装成500mg/管，-20℃冷冻保存。在样本采集过程中，切割获取的骨片可参考上述处理方法。在样本采集过程中，钻取的骨粉应先用5%次氯酸溶液中浸泡5min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.3.2牙齿的处理首先用毛刷清理牙齿表面的泥土或其他沉积物，将清理后的牙齿置于5%次氯酸溶液中浸泡3WW/T0036—201215min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，紫外线照射30min，晾干。最后将牙齿放入冷冻研磨机中，液氮冷却，打磨成牙粉，分装成500mg/管，-20℃冷冻保存。在样本采集过程中钻取的牙粉，应先用5%次氯酸溶液中浸泡5min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.3.3软组织的处理采集的毛发样本，依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。采集的皮肤、肌肉、脑和内脏样本，应先用无水乙醇擦拭表面，再用剪刀将其剪碎后，置于5%次氯酸溶液中浸泡15min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.4DNA提取原理本标准推荐三种基于硅法的DNA提取方法：硅粒法、硅离心柱法a、硅离心柱法b，其原理是：在高盐溶液中，DNA可与二氧化硅结合，并能够被低盐溶液或水洗脱，通过简单的结合—清洗—洗脱步骤即可获得纯DNA。——硅粒法：利用二氧化硅微粒与DNA结合。——硅离心柱法：利用离心柱中的硅胶膜与DNA结合。5.5硅粒法5.5.1试剂除非另有规定,硅粒法所需试剂。5.5.1.1二氧化硅微粒Silicondioxide（SiO2）。5.5.1.2异硫氰酸胍Guandinethiocyanate（GuSCN）。5.5.1.3乙二胺四乙酸Ethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）。5.5.1.4蛋白酶KProteinaseK。5.5.1.5三羟甲基氨基甲烷Trishydroxymethylaminomethane（Tris）。5.5.1.6氯化钠Sodiumchloride（NaCl）。5.5.1.7盐酸Hydrochloricacid（HCl，37%）。5.5.1.8无水乙醇Ethanol（100%，EtOH）。5.5.2缓冲液利用5.5.1中的试剂配制下列缓冲液。5.5.2.1裂解缓冲液（0.45mol/LEDTA，0.25mg/mL蛋白酶K，pH8.0）。5.5.2.2DNA结合缓冲液（5mol/LGuSCN，25mmol/LNaCl，50mmol/LTris），室温避光保存。5.5.2.3DNA清洗缓冲液（50%EtOH，125mmol/LNaCl,10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH8.0）。5.5.2.4DNA洗脱缓冲液（10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，pH8.0）。5.5.3二氧化硅微粒悬浮液1）二氧化硅微粒悬浮液的配制步骤如下：a）称量4.8g二氧化硅微粒，置于50mL离心管中，加入超纯水至40mL刻度线，涡旋振荡后，室温静置1h；b）吸取39mL上清液到一个新的50mL离心管，涡旋振荡后，室温静置4h；c）移除35mL上清液，加入39μLHCl,涡旋振荡混匀，室温避光保存。5.5.4DNA提取步骤1）BIO101公司的AncinetDNAGLASSMILK或QIAGEN公司的QIAEXⅡSuspension是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这些产品的认可。45.5.4.1DNA释放在裂解缓冲液的作用下，DNA从样本组织细胞中释放出来，具体步骤如下：WW/T0036—2012a）在装有500mg样本的15mL离心管中加入10mL裂解缓冲液，同时设置空白对照；b）用封口膜封好盖子，放入摇床，37℃、150r/min振荡16h-24h。5.5.4.2DNA与二氧化硅微粒结合DNA释放后，需将DNA与二氧化硅微粒结合，具体步骤如下：a）将上述样本及空白对照6000×g离心2min，转移上清液至新的50mL离心管中；b）加入40mLDNA结合缓冲液和100μL二氧化硅悬浮液，用浓盐