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刘闯、魏巍、乔艳、苏瑞锐摘要:SPR技术作为检测,分析生物分子相互作用的有效工具,有些国家已经生产出成熟的商业化的SPR传感系统。对SPR生物传感器的工作原理,应用领域,最新进展作出阐述,并对其在生物分子检测领域的应用和研究发展前景进行了讨论。引言:表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonancetechnology,SPR)是20世纪90年代发展起来的一种生物分子检测技术,是基于SPR检测生物传感芯片(biosensorchip)上配位体与分析物作用的一种前沿技术,在20世纪初,Wood观测到连续光谱的偏振光照射金属光栅时出现了反常的衍射现象,并且对这种现象进行了公开描述。1941年,Fano用金属与空气界面的表面电磁波激发模型对这一现象给出了解释。1957年,Ritchie发现,当电子穿过金属薄片时存在数量消失峰。他将这种消失峰称之为“能量降低的”等离子模式,并指出了这种模式和薄膜边界的关系,第一次提出了用于描述金属内部电子密度纵向波动的“金属等离子体”的概念。2年后,Powell和Swan用实验证实了Ritche的理论。随后,Stem和Farrell给出了这种等离子体模式的共振条件,并将其称为“表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance,SPR)”。1968年,Otto和Kretschmann等人研究了金属和介质界面用光学方式激发SPR的问题。并分别设计了两种棱镜耦合方式。此后,SPR技术获得了长足的发展。1990年,国际上第一台商业生产的生物传感器在瑞典的Biocore公司诞生。实践证明,SPR传感器与传统检测手段比较,具有无需对样品进行标记,实时监测,灵敏度高等突出优点。所以,在医学诊断,生物监测,生物技术,药品研制和食品安全检测等领域有广阔的应用前景。基本原理1消失波,在波动光学没有发展起来以前,菲涅尔定理很好地描述了光在介质表面的行走路径。(n1sinθ1=n2sinθ2),可以看出,当光从光密介质入射到光疏介质时(n1n2)就会有全反射现象的产生。但以波动光学的角度来重新研究全反射的时候就会发现,全反射的光波会透过光疏介质约为光波波长的一个深度,再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。光的总能量没有发生改变。透入光疏介质的光波成为消失波。图2消失波在界面的传播2表面等离子波;等离子体通常是指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体,其中正、负带电粒子数目几乎相等,内部不形成空间电荷。如果把金属的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体,这实际上也是一种等离子体。当金属受到电磁干扰的时,金属中的电子密度分布就会变得不均匀。设想在某一区域电子密度低于平均密度,那么就会形成局部的正电荷过剩。这时由于库仑引力作用,会把近邻的电子吸引到该区域,而被吸引的电子由于获得附加的动量,又会使该区域聚集过多的负电荷,然而,由于电子间的排斥作用,使电子再度离开该区域,从而形成价电子相对于正电荷背景的起伏振荡。由于库仑力的长程作用,这种局部的电子密度振荡将形成整个电子系统的纵向集体振荡,并以密度起伏的波的形式来表现。可知,金属中的价电子相当于正离子背景的这种振荡与导电气体中的等离子振荡相似,故称为金属中的等离子振荡。表面等离子振荡也是如此,我们可以看成其内部也有一定的电子振荡波的存在。3当光线在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时,会在金属膜中产生消失波,消失波与表面等离子波发生共振时,检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子,入射光的大部分能量被表面等离子波吸收,使得反射光的能量急剧减少。因此,可以反射光强的响应曲线看到一个最小的尖峰,此时对应的入射光波长为共振波长,对应的入射角为共振角。SPR角随金表面折射率变化而变化,而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。这就是SPR对物质结合检测的基本原理。SPR传感系统一般是由光学系统,传统系统和检测系统这3部分组成的。其中,光学系统包括光源和光路,用以产生合乎性能要求的入射光;传感系统利用上述原理将待测信息转换为敏感膜的折射率的变化,并通过光学耦合转换为共振角或共振波长的变化;检测系统检测反射光的发光强度,记录共振吸收峰的位置,当入射波以某一角度或某一波长入射,近场波矢K和SPW的波矢相等,发生谐振,入射光能量耦合到SPW波,反射光强度出现一个凹陷。此时的入射光角度称为SPR角。SPR角随金表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比图3SPR检测原理当入射波以某一角度或某一波长入射,近场波矢K和SPW的波矢相等,发生谐振,入射光能量耦合到SPW波,反射光强度出现一个凹陷。此时的入射光角度称为SPR角。SPR角随金表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比.(生物秀实验频道)仪器工作原理:以瑞典的Biacore3000型SPR仪为例,介绍这种仪器的工作原理。Biacore3000由工作单元和一台安装有BiacoreControl软件的电脑组成。工作单元又分为液体处理单元和光学系统。Biacore3000的工作单元由以下6部分组成两个液体传送泵:其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传感芯片表面,另一个泵负责自动自动进样装置中的样品传送自动上样装置(autosampler):负责样品的混合、注射和回收。一体化U型射流器(Integratedu-FluidicCartridge,IFC):包含液体传送通道,样品环和阀门。检测单元:包括能够产生和测量SPR信号的光电组分。四个可探测的液体池(flowcell):该液体池通过将IFC靠在传感芯片上而形成。微处理装置(microprocessors):它能控制泵,自动上样装置,和IFC的阀门并且能对SPR信号作基本的处理。传感芯片插入检测单元的芯片盒中,引入(dock)仪器后于IFC共同形成液体池。IFC通过连接块与缓冲液相连。连接块上有注射口,通过注射口可以将样品加载到IFC上。温度控制SPR信号对于温度变化非常敏感,所以在整个实验过程中保持传感芯片表面的温度恒定是非常重要的Biacore3000采用Peltier元件来控制传感芯片的表面温度。会不停的闪烁。如果温度不稳定,仪器前部面板上的黄色LED(light-emittingdiode通过预先设定,我们可以把温度控制在4-40ºC之间任意一点(不能比环境温度低20度)(生物秀实验频道)LED状态指示器仪器前部面板上有5个LED状态指示器:Ready(green):灯亮表示电源打开,仪器准备就绪。Error(red):灯亮表示仪器出现问题,当电源打开时,此灯亮几秒钟,如果在其他情况下亮起都说明仪器出现了严重的问题。Temperature(yellow):灯光稳定代表温度稳定,灯光闪烁说明温度不稳定。Sensorchip(green):灯光稳定代表传感芯片安装到位,灯光闪烁表明未安装传感芯片或安装不到位,出现错误。Run(green):仪器在工作时此指示灯亮起。SPR仪的传感芯片应用于SPR仪的传感芯片(sensorchip)有两个基本特征:首先是传感芯片玻璃表面覆盖有薄薄的金层,这是产生SPR信号所必需的条件,是探测生物分子间相互作用的基础;另外一个特征是,在金层的上面又有一种覆层,这种覆层不影响SPR效应,能够连接配体并为所要研究的分子相互作用提供适宜的环境。为方便起见通常我们把连接在传感芯片上的分子称为配体(ligand),把代测的分子称为分析物(analyte)。传感芯片表面的金层和其上的覆层是很稳定的,它能够耐受极端PH和许多中等浓度的有机试剂。一旦配体被固定在传感芯片上之后,传感芯片对于各种试剂和条件的耐受程度就主要取决于所连配体的性质。传感芯片本身镶嵌在塑料的载体上,并有一个塑料鞘,以方便使用。图7传感芯片示意图SPR是入射光的衰势波与介质表面的等离子波形成共振,只要能到达到共振就能有spr现象产生,所以根据SPR有4种分析方法1角度调制法:固定入射光的波长,改变入射角度,观测到反射光的归一化强度2波长调制法:固定入射光的角度,改变入射光的波长,观测入射光的归一化强度3强度调制法:如射光的角度和波长都固定,凭借强度的变化测量折射率的变化4相位调制法:入射光的角度和波长都固定,观测反射光和入射光的相差。美国热电公司分子光谱部以其10年傅立叶变换红外技术经验结合最新的SPR技术推出了崭新的FT-SPR检测模块-SPR100,与角度扫描型SPR检测技术不同,SPR-100的特征是在SPR检测体系中固定入射光的角度,当在某一特定波长发生等离子共振现象时,入射的p-偏振光的能量几乎被完全吸收,从而检测到金属表面分子间的相互作用。光纤藕合结构的SPR传感器采用光纤作为光的传输媒质.由于光纤的特殊性,这种传感器具有其他结构所没有的特点:它可以很方便地探测一些人类难以进入或者有害的地方,可以通过光线对敏感信号的传输,实现远程检测和分布式检测,而且也可以达到较高的灵敏度.光纤藕合传感器一般是将普通光纤部分保护层剥离,将纤芯裸露出来,再在纤芯外包裹金属膜层及敏感层,检测时,将该部分与样液接触。从而实现方便灵敏的检测。SPR检测系统和检测仪器主要作用于生物特异相互作用的分析,与传统相互作用技术如超速离心,荧光法,热量测定法等相比,具有检测过程方便快捷,灵敏度高;无需标记样品,保持了分子活性;样品需要极少;大多数情况下,不需要对样品进行处理;高通量,高质量的分析数据;能在混浊的甚至不透明的样品中进行等特点,所以在检测领域有着更加广阔的应用。Karlsoon等应用SPR检测系统的自动生物特异相互作用分析进行了单克隆抗体-抗原相互作用的动力学研究,Mackenzie等用生物特异相互作用分析进行了细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析。SPR生物传感器的应用自Liedberg等于1983年首次运用SPR技术进行抗原抗体相互作用分析以来,SPR生物传感器技术已被广泛应用于蛋白质组学,细胞信号传导,受体/配体,抗体/抗原分子垂钓,免疫识别,癌症研究和新药筛选等生命科学领域,用于实时和动态研究蛋白质-蛋白质,蛋白质-核酸,新药分子-靶蛋白等生物分子互作过程。特别是1990年,商业化的SPR应用以来,SPR生物传感器从根本上改变了生物分子识别科学,成为生命科学和制药研究上的标准工具。此外在食品,环境科学,临床诊断,基因测序,疾病治疗,案件侦破,兴奋剂检测等应用领域不断扩展。(1)在检测方面,主要应用于物理量检测,化学检测和生物检测。物理量检测上,主要利用SPR传感器技术进行检测的湿度传感系统及基于氢化无定型硅的热光效应的温度系统。化学检测上,主要利用SPR传感器通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成分,浓度及参与化学反应的特性。生物检测上,主要用于检测生物分子的结合作用或者通过生物分子结合作用的检测来完成特定生物分子的识别及其浓度的测定,比如早期抗原-抗体的相互作用,streptatividin和维生素H的相互作用及一些IgG的检测。近年来,还涉及到蛋白质之间或者蛋白质与DNA相互作用检测以及蛋白质结构变化的检测,抗肿瘤蛋白APC的生物化学属性的检测,酶蛋白与单克隆抗体的动态反应过程的检测,还有细胞色数C,葡萄糖,机球素,铁蛋白,香烟中的烟碱,破伤风毒素,艾滋病的检测等。近年来,还出现了利用SPR检测方法来监测酶促反应的动态过程。(2)药物筛选。SPR技术因其实时,高通量,特异性及能在天然状态下研究药物分子与靶点的相互作用,为新药研发提供了有力的工具。在药物筛选,药物分子靶点鉴定及先导药物化合物的结构优化方面有着广泛的应用。当前发展中的药物筛选生物传感器的测试包括两方面内容,一是从文库中筛选与靶蛋白结合的化合物;二是进行一般的ADME试验。(3)蛋白质组学。SPR技术因其高效灵敏无需额外标记等优势,广泛应用与蛋白质检测和蛋白-蛋白相互作用等蛋白质组学研究,它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布,结合动力学及浓
本文标题:表面等离子共振技术
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