GBT 38488-2021 微生物快速测定方法

书书书犐犆犛０７．０８０犆犆犛犃２１中华人民共和国国家标准犌犅／犜３８４８８—２０２１微生物快速测定方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊２０２１１２３１发布２０２２０７０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书前　　言　　本文件按照ＧＢ／Ｔ１．１—２０２０《标准化工作导则　第１部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国标准化研究院提出并归口。本文件起草单位：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国标准化研究院、天津海关工业产品安全技术中心、江汉大学、北京工商大学、武汉旭东食品有限公司、北京萨姆伯科技有限公司、华测检测认证集团北京有限公司、中国农业大学。本文件主要起草人：张捷、马爱进、柳明、赵琢、彭海、畅晓晖、张园、贾英民、高欣、杨向莹、张惠媛、何旭东、郝帅、李小林、董立雅、张昊、王华、陈广全、彭彦昆。Ⅰ犌犅／犜３８４８８—２０２１微生物快速测定方法１　范围本文件规定了用分子马达法、近红外免疫层析法和目标区域测序法快速测定微生物的方法。本文件中第一法———分子马达法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌（犔．犿狅狀狅犮狔狋狅犵犲狀犲狊）、副溶血性弧菌（犞犻犫狉犻狅狆犪狉犪犺犲犿狅犾狔狋犻犮狌狊）、霍乱弧菌（犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲）、沙门氏菌（犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪）、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）（犆狉狅狀狅犫犪犮狋犲狉狊犪犽犪狕犪犽犻犻）、志贺氏菌（犛犺犻犵犲犾犾犪）、甲型肝炎病毒（犎犲狆犪狋犻狋犻狊犃狏犻狉狌狊，犎犃犞）的快速测定；第二法———近红外免疫层析法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、轮状病毒（犚狅狋犪狏犻狉狌狊）、诺如病毒（犖狅狉狅狏犻狉狌狊）、甲型肝炎病毒的快速测定；第三法———目标区域测序法适用于食品和生活饮用水中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌（犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犪狌狉犲狌狊）、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶耳森氏菌（犢犲狉狊犻狀犻犪犲狀狋犲狉狅犮狅犾犻狋犻犮犪）、空肠弯曲菌（犆犪犿狆狔犾狅犫犪犮狋犲狉犼犲犼狌狀犻）、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（犈狀狋犲狉狅犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犈．犮狅犾犻Ｏ１５７）、霍乱弧菌、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）、创伤弧菌（犞犻犫狉犻狅狏狌犾狀犻犳犻犮狌狊）和溶藻弧菌（犞犻犫狉犻狅犪犾犵犻狀狅犾狔狋犻犮狌狊）的快速测定。２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。４　分子马达法４．１　原理ＡＴＰ合成酶属于一种旋转型分子马达，由跨膜质子（Ｈ＋）梯差驱动，其上的ε亚基为转子，转子负载越大，分子马达转速越低、跨膜转运的质子（Ｈ＋）数量越少。在ＡＴＰ合成酶的ε亚基上连接ε亚基抗体链霉亲和素生物素核酸探针（见附录Ａ表Ａ．２），当探测到目标病原微生物特异性基因序列并与其结合时，分子马达的转速变化可以间接地通过载色体（ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ）膜外标记的对ｐＨ敏感的荧光探针１，２双十六烷基３甘油磷酸乙醇胺（ＤＨＰＥ）来检测，从而实现对目标病原微生物的定性测定。４．２　试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。４．２．１　水：ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水。４．２．２　ＤＮＡ提取试剂盒。１犌犅／犜３８４８８—２０２１４．２．３　ＲＮＡ提取试剂盒。４．２．４　分子马达检测试剂盒：见表Ａ．１。４．２．５　荧光素酶溶液：将荧光素酶／荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶／荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞反复颠倒混匀，不可振荡。４．２．６　异硫氰酸胍溶液：６ｍｏｌ／Ｌ。４．２．７　阳性对照：以标准菌株或病毒提取ＤＮＡ，作为阳性对照。４．２．８　阴性对照：以不含目标微生物的样品，提取ＤＮＡ，作为阴性对照。４．３　仪器设备４．３．１　恒温水浴锅：０℃～１００℃。４．３．２　涡旋振荡器。４．３．３　离心机：１５０００犵。４．３．４　移液器：单道２０μＬ，５０μＬ，１００μＬ，１０００μＬ；多道５０μＬ～２５０μＬ。４．３．５　电子天平，感量０．０１ｇ。４．３．６　荧光光谱仪：配备９６孔板及相应装置。４．３．７　离心管：１．５ｍＬ。４．４　病原菌４．４．１　操作步骤４．４．１．１　样品制备、增菌培养和分离见附录Ｂ。４．４．１．２　犇犖犃提取挑取可疑菌落，用ＤＮＡ提取试剂盒进行提取，所得菌体ＤＮＡ提取液作为样品待测液。制备好的ＤＮＡ样品应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于冰箱中－２０℃保存，使用时置于室温自然解冻，涡旋振荡混匀。４．４．１．３　犇犖犃变性取４．４．１．２中的样品待测液１０μＬ分别加入６个１．５ｍＬ离心管，置于恒温水浴锅中，沸水浴中加热３ｍｉｎ，立刻转移到冰浴中，静置冷却。４．４．１．４　配制反应体系４．４．１．４．１　分别取病原菌分子马达探针溶液（见表Ａ．１）２μＬ，用合成缓冲液（见表Ａ．１）稀释到一定的倍数。取稀释后的分子马达探针溶液１０μＬ分别加入４．４．１．３的各离心管中。４．４．１．４．２　向４．４．１．４．１的各离心管中加入３０μＬ启动缓冲液（二磷酸腺苷ＡＤＰ和合成缓冲液按体积比１∶３混合配制），涡旋振荡混匀，立即离心去除管盖内壁上的水珠，放入３７℃恒温摇床中温育３０ｍｉｎ。取出离心管后分别加入４５０μＬ１×ＰＢＳ缓冲液（见表Ａ．１），涡旋振荡混匀，形成最终反应体系。４．４．１．５　加样与测定用无菌水代替样品待测液，其他步骤不变制备空白对照。用无菌水代替样品待测液，不加入分子马达探针，其他步骤不变制备本底对照。将４．４．１．４．２处理后的最终反应体系、空白对照及本底对照分别加入洁净的９６孔板中，每个反应体系加３个孔，空白对照和本底对照各加３个孔，每孔５０μＬ。每孔分２犌犅／犜３８４８８—２０２１别加入３０μＬ荧光素酶溶液（１μｍｏｌ／Ｌ），用移液器混匀各孔溶液。荧光光谱仪设定激发波长为４９６ｎｍ，发射波长为５１９ｎｍ，测定各孔荧光度值（ＯＤ值），用最终反应体系荧光度值减去本底荧光度值和空白对照荧光度值即为样品的实际荧光度值。４．４．２　结果及判定４．４．２．１　结果计算荧光差值按式（１）计算：Δ犉＝犅－犅０－犅Ｈ２Ｏ犅－犅０×１００％…………………………（１）　　式中：Δ犉———荧光差值；犅———样品荧光度值；犅０———空白对照荧光度值；犅Ｈ２Ｏ———本底对照荧光度值。４．４．２．２　结果分析将样品荧光度值绝对值与Ｈ２Ｏ的空白对照荧光度值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（狆＜０．０５）则表示检出该基因。４．４．２．３　结果判定两次样品荧光差值平均值大于１０％，则结果判定为阳性；两次样品荧光差值平均值小于或等于１０％，则结果判定为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录Ｂ中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。４．５　病毒４．５．１　操作步骤４．５．１．１　提取见附录Ｂ。４．５．１．２　犚犖犃提取向４．５．１．１的沉淀中加入６ｍｏｌ／Ｌ的异硫氰酸胍溶液１ｍＬ，涡旋振荡使沉淀充分溶解，使用试剂盒进行ＲＮＡ提取，所得病毒ＲＮＡ提取液作为样品待测液。制备好的ＲＮＡ应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于－８０℃保存备用。４．５．１．３　犚犖犃变性取４．５．１．２中的样品待测液１０μＬ加入１．５ｍＬ离心管，置于恒温水浴锅中９５℃水浴５ｍｉｎ，立即转移至５０℃水浴静置１ｍｉｎ。４．５．１．４　配制反应体系取病毒分子马达探针溶液（见表Ａ．１）２μＬ，其他操作步骤同４．４．１．４。４．５．１．５　加样与测定用无菌水代替样品待测液，其他步骤不变制备空白对照。用无菌水代替样品待测液，不加入分子马３犌犅／犜３８４８８—２０２１达探针，其他步骤不变制备本底对照。将４．５．１．４处理后的最终反应体系、空白对照及本底对照按照４．４．１．５步骤进行加样与测定。４．５．２　结果及判定４．５．２．１　结果计算检测结果按式（１）计算。４．５．２．２　结果判定两次样品荧光差值平均值大于１０％，则结果判定为阳性；两次样品荧光差值平均值小于或等于１０％，则结果判定为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录Ｂ中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。５　近红外免疫层析法５．１　原理利用近红外荧光染料标记抗体，双抗体夹心免疫层析原理制备试纸条。在抗体垫上固定有近红外荧光标记的抗致病菌或病毒单克隆抗体和作为质控物的近红外荧光标记的鸡ＩｇＹ多克隆抗体。当含有致病菌或病毒的样品滴加到试纸条样品垫上后，靶标致病菌或靶标病毒与抗体垫上的标记抗体结合，形成荧光标记物标记抗体靶标分子复合物。复合物随溶液向试纸条前端迁移，当复合物迁移至检测线时，被固定于检测线上的抗致病菌或病毒抗原的另一株单克隆抗体所捕获。荧光标记的鸡ＩｇＹ多克隆抗体随溶液继续迁移，到达质控线时被固定于质控线上的山羊抗ＩｇＹ多克隆抗体所捕获。利用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别扫描质控线和检测线，以检测线与质控线荧光强度比值与阈值进行比较，大于或等于阈值判断为阳性，小于阈值判断为阴性。５．２　试剂和材料５．２．１　磷酸缓冲盐溶液（ＰＢＳ缓冲液）：ｐＨ７．４，含５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０。５．２．２　近红外免疫层析法检测试纸条，参数见附录Ｃ。５．３　仪器设备５．３．１　电子天平，感量０．０１ｇ。５．３．２　便携式近红外荧光扫描仪。５．４　测定步骤５．４．１　样品制备、增菌培养和分离见附录Ｂ。５．４．２　测定吸取５０μＬ样品待测液滴加到试纸条加样区，待吸收干后再滴加５０μＬＰＢＳ缓冲液，室温放置１５ｍｉｎ后，用便携式近红外荧光扫描仪分别测定所述检测线和质控线的荧光强度，激发波长７７５ｎｍ±５ｎｍ，发射波长为７９５ｎｍ±５ｎｍ，分析结果。４犌犅／犜３８４８８—２０２１５．５　结果及判定若试纸条质控线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若检测线荧光扫描峰面积与质控线荧光扫描峰面积比超过阈值（阴性对照值＋３ＳＤ）则为阳性结果，反之则为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录Ｂ中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。６　目标区域测序法６．１　原理样品制备、增菌培养和分离后，提取样品基因组ＤＮＡ，经过连接接头序列、ＰＣＲ扩增连接产物、探针捕获扩增产物、获得测序文库、高通量测序、分析测序数据等过程，得出检测结论。６．２　试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。６．２．１　文库构建试剂盒。６．２．２　高通量测序试剂盒。６．２．３　探针：符合附录Ｄ。６．２．４　人工ＤＮＡ：符合附录Ｅ。６．３　仪器设备６．３．１　高通量测序仪。６．３．２　分光光度计。６．４　检测步骤６．４．１　样品制备、增菌培养和分离见附录Ｂ。６．４．２　提取基因组犇犖犃取培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）提取并纯化基因组ＤＮＡ。提取与纯化的ＤＮＡ溶液在２６０ｎｍ与２３０ｎｍ处的吸光度值的比值大于２．０；在２６０ｎｍ与２８０ｎｍ处的吸光度值的比值介于１．７与１．９之间；ＤＮＡ电泳主带明显，无明显降解和ＲＮＡ残留。６．４．３　文库构建６．４．３．１　利用文库构建试剂盒及其操作说明进行文库构建。６．４．３．２　利用酶切消化或机械破碎的方法，将待测样品和质控样品基因组ＤＮＡ片段化至１００ｂｐ～１０００ｂｐ。６．４．３．３　对６．４．３．２中获得的产物进行末端修复并连接接头序列。接头序列应包括三个部分：约２０个碱基的通用序列、８个碱基组成的随机条形码序列和１２个碱基的样品条形码序列。其中，不同的待测样品或质控样品使用不同的样品条形码序列，且在同一个实验室中相同的样品条形码序列在３０ｄ内只使用一次。按试剂盒纯化连