北京大学-分子生物学课件第10讲

第九章基因与发育9.1免疫体系发育及免疫球蛋白基因表达免疫体系(TheImmuneSystem)是Vertebrates所特有的．Immunityresultsfromthecombinedactivitiesofmanydifferentcells,someofwhichpatrolthebody,whereasothersareconcentratedinlymphoidorgans,suchasthebonemarrow,thymus,spleenandlymphnodes.免疫系统的细胞通过一个被称为“分子识别”的过程鉴别“外来物质”．一旦检测到有外来物质存在，它们就用产生特异性抗体或类似方法将其消灭．免疫系统是动物的主要防御系统，包括淋巴细胞（lymphocyte，分B淋巴细胞和T淋巴细胞）及组织相容性抗原两部分。巨噬细胞（macrophage）也参与免疫反应。黄色部分是呈递于Ｔ－淋巴细胞表面的Ｔ－细胞受体，蓝色部分是展示在受感染细胞表面的ＭＨＣ蛋白，白色部分是来自某个感染人体的逆转录病毒的特征性多肽．T淋巴细胞产生于胸腺（thymus），它的主要功能是产生T淋巴细胞受体，识别产生抗体的B淋巴细胞，以帮助巨噬细胞发挥功能。组织相容性抗原（histocompatibilityantigen），保证机体识别自身细胞和异源细胞，参与淋巴细胞及其他许多细胞间的反应。B淋巴细胞由骨髓产生，主要功能是制造用于对付外来抗原的抗体，它专一地识别相应的抗原。吞噬细胞细菌细菌ComplementNK细胞病毒IFN-α受感染正在凋亡的细胞受感染细胞有抵御病毒感染能力的细胞先天性免疫系统（非特异性）抗体细菌毒素获得性免疫系统（特异性）细菌被抗体分子所包裹抗体包膜T-细胞病毒受感染正在凋亡中的细胞抗体、T淋巴细胞受体和组织相容性抗原是免疫系统中3种昀重要的成份。这3类蛋白的共同特点：多样性。每类蛋白质都由一个巨大的基因家族编码，有许多变异型。在抗体和T淋巴细胞受体中，基因片段重排导致了所编码蛋白质的多样性。9.1.1脊椎动物免疫系统脊椎动物免疫系统产生的抗体能识别和结合数百万种潜在的“非本身”的抗原分子（antigen），说明免疫细胞要合成数量巨大的抗体分子(antibody)。生物体内存在着两条不同的免疫途径：体液免疫（humoralimmunity），和细胞免疫（cellularimmunity）。在体液免疫中，B淋巴细胞首先识别外源致病因子或其他任何形式的抗原，通过浆细胞（即成熟B淋巴细胞）不断分泌出能溶于血液蛋白质中的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig(抗体)分子通过特定的结合位点形成抗原-抗体复合物，昀终被巨噬细胞所吞噬。Ig昀高可占血液总蛋白的20%。在细胞免疫体系中，受体细胞产生出类似Ig、但紧密结合在细胞膜表面的蛋白质分子，与T淋巴细胞表面的受体专一结合，导致感染细胞被后者降解。图9-1生物体内存在的两条主要免疫途径：体液免疫和细胞水平免疫图示.两类获得性免疫反应都由在血液和淋巴组织之间循环的淋巴细胞（nucleatedleukocytes,whitebloodcells）所介导。体液免疫由B淋巴(细胞)介导；细胞免疫体系由T淋巴(Ｔ细胞)介导。9.1.2B淋巴细胞及其发育和分化哺乳动物B细胞产生于骨髓中。成熟B细胞主要存在于淋巴结皮质浅层的淋巴小结及脾脏的红髓与白髓淋巴小结内，在抗原刺激下可分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白来识别相应的外来抗原，执行机体的体液免疫功能。图9-2B细胞和T细胞的发育过程。1.B细胞的分化哺乳类动物B细胞的分化过程可分为以下几个阶段：祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞、和成熟B细胞等。其中祖B细胞、前B细胞、未成熟B细胞的分化不依赖于抗原，其分化过程在骨髓中完成。骨髓早期祖B细胞重链基因D-J重排晚期祖B细胞重链基因V-DJ重排大前B细胞表达μ链表达pre-BCR(μ:λ5/Vpre-B）小前B细胞表达μ链(胞浆和胞膜)轻链V-J重排表达pre-BCR未成熟B细胞表达μ链IgM表达轻链成熟B细胞表达μ、δ链IgMIgD表达轻链重链或轻链基因重排失败细胞丢失结合抗原克隆删除自身免疫耐受向外周B细胞库运输图9-3B细胞的发育和分化祖B细胞(pro-Bcell)由骨髓淋巴细胞分化而来，仅存在于骨髓、胎肝等组织中。在早期祖B细胞中，D－J基因片段开始重排，并开始表达B细胞受体(Bcellreceptor，BCR)复合物中的Igα和Igβ。在晚期祖B细胞中V－DJ发生重排。根据前B细胞的形态以及轻链基因的重排，可将其分为大前B细胞和小前B细胞。大前B细胞VDJ重排后表达μ链，并表达前B细胞受体。小前B细胞轻链只发生V－J发生重排，无功能性Ig表达，缺乏对抗原的反应能力。2.B细胞膜表面分子标记膜表面球蛋白是B细胞的重要标志，是B细胞特异性识别抗原的受体。未成熟B细胞表达IgM，成熟B细胞同时表达IgM、D、G、A和E。B细胞表面Ig的可变区都由VH和VL基因编码。记忆B细胞表面不存在IgD，抗原刺激后B细胞表面IgD也消失。9.1.3T淋巴细胞发育及分化T淋巴细胞(Tlymphocyte)，简称T细胞，来源于骨髓淋巴样干细胞，其主要功能是产生T淋巴细胞受体。T细胞不仅直接执行细胞免疫功能，而且还可以通过产生多种细胞因子或表达黏附分子等手段，与其他免疫细胞发生直接或间接的相互作用，从而发挥广泛的免疫调节功能。1.T细胞的分化与发育研究小鼠胸腺细胞的发育过程表明，在胚胎发育到11-12天时，淋巴干细胞进入胸腺，并在胸腺微环境的影响下迅速发生增殖和分化。诱导T淋巴细胞在胸腺内分化、成熟的主要因素有：胸腺基质细胞分泌多种细胞因子及胸腺激素，通过其细胞表面的黏附分子直接与胸腺细胞发生相互作用，诱导后者分化；胸腺中的“抚育细胞”参与调控T细胞的成熟和分化；胸腺细胞自身可分泌多种细胞因子，影响本身的分化和成熟；巨噬细胞、胸腺内上皮细胞和树突状细胞也参与胸腺细胞分化过程。2．Notch信号与T细胞分化在免疫系统发育过程中，Notch信号途径使淋巴干细胞向T细胞前体分化，表达功能性TCRαβ而非TCRγδ，并使CD4＋CD8＋T细胞向CD4－CD8＋T细胞表型分化。Notch信号决定了骨髓淋巴样干细胞向B系或T系方向分化，调控了CD4＋CD8＋T细胞的阳性选择过程,提高了胸腺中成熟的CD4－CD8＋T细胞比例，促进了TCRαβ型T细胞的形成。βTCR基因重排CD4-CDθ-TCR祖B细胞TCR基因重排图9-5Notch信号对淋巴细胞分化与发育的调控作用3．T细胞表面受体T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)是T淋巴细胞表面识别自身MHC-抗原肽复合物的受体，含有α、β、γ和δ四种多肽，属于免疫球蛋白基因超家族的成员。它与CD3在细胞表面组成TCR-CD3复合物，并传递抗原刺激信号。9．1．4免疫球蛋白的结构抗体的基本结构是一个四聚体的免疫球蛋白分子，由4条（两对）多肽链组成，包括两条相同的轻链（L-chain）和两条相同的重链（H-chain）。轻链约2.3×104，重链则介于5.3×104~7.0×104之间。图9-6Ig分子结构示意图。VH，重链可变区；CH1,CH2,CH3,重链不变区；VL，轻链可变区；CL，轻链不变区根据抗体的重链结构特征将其分为5类（表9-1），再根据抗原的不同和结构的变化又可分出若干亚类。每种类型都有一个特征性的恒定区。表9-1抗体的分类性质IgMIgDIgGIgEIgA重链μδγεα结构(U2L2)5Jδ2L2γ2L2ε2L2α2L2占总量Ig(%)5180%＜114在成年人血清中的平均含量（g/L）10.03120.00032半衰期（d，在血清中）532526特征出现较早，具有确定补体、有激活巨噬细胞的功能以细胞表面为主，少量存在于血清中激活互补并与巨噬细胞相结合刺激肥大细胞，释放组胺分泌蛋白9.1.5免疫球蛋白基因结构免疫球蛋白分子由Igk、Igl和Igh基因编码，位于不同的染色体上。1965年，Dreyer和Bennet认为，Ig的V区和C区由分隔存在的基因所编码，这些基因片段在淋巴细胞分化和发育过程中发生易位重排，形成有转录活性的免疫球蛋白基因。Hozumi和Tonegawa在1976年应用DNA重组技术证实了这一假说。Tonegawa因在免疫球蛋白基因结构研究上的重大突破获1987年诺贝尔生理医学奖。1.免疫球蛋白轻链基因结构1）κ基因。位于人类第2号染色体上，其可变区和恒定区分别由不连续的V基因和C基因编码。V与J基因以多拷贝形式存在，其中V基因簇含有约300个拷贝。人类和小鼠的J基因簇都包含5个J基因，位于V基因簇的3’端，与昀后一个V基因的3’端相距23kb，与κ链恒定区C基因的5’端相距约2.5kb。人和小鼠的C基因都是单拷贝，它编码了κ链C区的106个氨基酸序列（第109-214位氨基酸）。2）λ基因。小鼠有两个Vλ基因：Vλ1和Vλ2。人类Vλ基因有30个拷贝，可分为Vλ1-10十个亚群，Vλ1-5是主要亚群，比较保守。小鼠Cλ基因簇有4个拷贝，而人类Cλ基因有6个以上的拷贝。基因表达过程中，每个Vλ基因都和Cλ基因成对排列。κ链基因λ链基因重链基因图9-7人类Ig基因结构示意图2.免疫球蛋白重链基因结构人重链基因位于14号染色体，由V、D、J和C四种不同基因片段组成。编码重链V区基因长约1000－2000kb，包括V、D、J三组基因片段。每个V基因片段上游有L基因片段，编码20－30个疏水性氨基酸的信号肽。9.1.6Ig基因重排与DNA的多样性一个生物为什么能产生百万种以上（106~108）的Ig分子呢？其根本原因是V区和C区不同片段在DNA分子水平上发生了被称为种系重组的重排。单一种系状态的Ig基因是不能表达的，只有经过重排才有可能得到表达。1.轻链基因的重排与连接V和J重排是通过V基因3’端和J基因5’端之间的侧翼序列（又称识别序列）实现的。它具有一段由7个碱基组成的反向回文序列—CACAGTG，在V3’端紧接着回文序列的是11个碱基的间隔序列，而后是9个富含A、C的碱基。J5’端也包含有与上述7碱基及9碱基区相配对的序列，其间隔序列由23个碱基组成，不能与V3’端11个碱基配对，因而形成单链突起（茎环结构）。V、J结合后，上述茎环结构被切除，形成连续的V、J片段。图9-8Vκ与Jκ基因的重排是通过Vκ基因3’和Jκ基因5’端的识别序列完成的V基因簇中的任何一个V片段和J基因簇中的任何一个J片段在DNA水平上均可随机结合形成VJ单位。这种随机组合重排并不很不精确，造成了重排后的多样性。V3’和J5’常由于重排不精确而造成碱基丢失或错位，导致κ链中第96位以后的氨基酸编码发生改变，免疫球蛋白结构发生多样性变化。交互使用V和J基因间的重组位点，可以产生新的密码子，形成4个不同的重组框架，并在第96位密码子上产生3种不同的氨基酸，其中Arg密码子在种系基因组中是没有的，这是连接反应造成免疫球蛋白多样性的机制之一。图9-9V-J连接反应造成Ig多样性的分子机制2.重链基因的重排与连接重链基因虽然只有一个位点，但结构十分复杂。如小鼠重链基因就包含了大约上百个VH片段、10多个D片段和4个J片段以及下游17kb处的CH片段。V基因和D及J片段组合能产生4000个不同的V区，每个V区都能和CH基因相组合。人类的CH基因簇含有10个基因，小鼠CH基因簇只有8个基因。这些CH基因虽然都有表达活性，但在同一细胞中只有一个基因表达。1）VH、DH和JH基因的重排。重链基因要经过两次重排才得以完成，第一次重排发生于DH和JH之间，第二次重排发生于VH和DHJH之间，形成有转录功能的VHDHJH基因。第二次重排过程中，同样会产生不精确性，进一步造成免疫球蛋白的多样性。V区(数百个拷贝)D片段(~20拷贝)JH片段（4拷贝）未分化种系细胞第一次重排细胞分化第二次重排重链基因表达图9-10重链基因结构以及伴随细胞分化而来的基因重排人类基因组有300