酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化

酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化组员：王应龙王英刚王志军吴晓庆武正芳2012年11月【实验目的】1、了解和掌握乳酸菌菌的菌种特性2、掌握乳酸菌的分离检测及纯化方法【实验原理】乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。根据细胞形态为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌族（Streptococceae）和乳酸杆菌（Lactobacilleae）。在1.6%溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。【实验材料、仪器与试剂】实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、琼脂、无菌水【实验步骤】1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备2、脱脂乳试管的制备3、酸奶中乳酸菌的分离4、乳酸菌的检测、纯化培养（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备配料：（A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。（B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g，pH6.8，121℃湿热灭菌20min。操作：（1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1NNaOH或1NHCl调pH，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。（2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板。（2）、脱脂乳试管的制备直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10g与蔗糖5g，水95g（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。（3）、乳酸饮料或酸奶中乳酸菌的分离（1）、酸奶菌悬液的配制取1个洁净三角瓶，盛以90ml无菌水；7支试管，各盛9ml的无菌水；加塞包扎于在103kPa121℃高压蒸汽灭菌20Min。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振摇均匀，即为10-1的样品稀释液。将7只装9ml无菌水的无菌试管，依次编号1--7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管1--6中，稀释混匀便得到10-2～10-7的稀释液。酸奶菌悬液的配制另留一管不稀释留作对照（CK）10-310-410-510-610-210-79ml无菌水9ml无菌水9ml无菌水9ml无菌水9ml无菌水9ml无菌水90ml无菌水10-1花园酸奶10ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml1.0ml（2）、分离方法A．平板划线接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培养48小时。B．平板涂布用无菌移液管分别吸取10-5、10-6、10-7和无菌生理盐水的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的无菌溴甲酚紫牛乳培养基平板中；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。（4）、乳酸菌的检测、纯化培养(1)、初步检测恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。（2）、乳酸菌的分离纯化培养选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。【注意事项】采用溴甲酚紫牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。【结果与分析】1、接种不同浓度菌悬液培养基中乳酸菌落数稀释度10-510-610-7CK对照平板123123123123菌落数263245281161140138978473233各浓度平均菌落数264146853平均菌落数（减去CK后）1.46X10-72、革兰氏染色结果革兰氏染色结果为蓝紫色，证乳酸菌为革兰氏阳性菌3、脱脂乳试管检测乳酸杆菌试管中脱脂牛乳凝固，证为乳酸杆菌4、初步结果通过实验，我们可以得出如下结果：酸奶中乳酸菌称杆状或排成链状，乳酸菌菌落大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO的溶解圈。革兰氏染色后呈蓝紫色为阳性菌。脱脂乳试管牛乳凝固。请老师批评指正，谢谢！