020130530控制生奶安全需要新思维

控制生奶安全需要新思维--从奶和奶制品中的黄曲霉毒素谈起上海奶协专家委员会顾佳升奶牛场质量安全管理培训2013-05-30上海诺宝中心提纲1来源（略讲）2毒性（略讲）3监测（略讲）4加工应对的局限性5构建生奶风险预警体系的必要性6行业结构转型1.来源•由某些微生物，例如丝状真菌（filamentousfungi）、霉菌（mould）等，在生长繁殖过程中通过不同的代谢途径，例如多聚乙酰途径、氨基酸途径等，而产生的一类分子量不大、无抗原性的次级代谢产物，有的具有毒性（mycotoxin）（IFST,2009）。•其中之一组，被称为黄曲霉毒素（Aflatoxins）其化学结构均由二氢呋喃环和香豆素组成的衍生物，目前已分离鉴定出12种之多。•一般认为前者多为毒物结构，与后者结合后能致癌。•这些霉菌毒素常残留在微生物活动的寄主机体上，主要是植物和藻类。4-羟基香豆素•呋喃香豆酮二氢呋喃环和香豆素组成的主要衍生物B1G1M1•饲料由于生产和贮存不当，如谷物在生长、收获及后期的贮存过程中发霉，因此遭霉菌毒素污染时有发生（Smith&Henderson,1991;CAST,2003;Driehuis等,2008）。•目前已发现了300多种的霉菌毒素，约20种在饲料和食品中含量达到显著水平（Smith等，1994）。依据毒性的大小，它们是：黄曲霉毒素、赭曲霉素、伏马菌素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等，因而倍受各国及组织关注（FAO,2004;IFST,2009）。•对霉菌毒素的关注始于20世纪60年代，当时在英格兰10万只火鸡突然发病死亡，究其原因是由黄曲霉（Aspergillusflavus）产生的有毒代谢物质，即黄曲霉毒素所致（Sargeant等,1961）。•人们很快发现奶牛食用黄曲霉毒素污染的饲料后，可在牛奶中产生有毒的代谢产物（Allcroft&Carnaghan,1962;1963），即M1。与牛乳有关的霉菌毒素•奶牛在食用了黄曲霉毒素、赭曲霉素、伏马菌素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等霉菌毒素污染的饲料后，在乳汁中均可检测到相应的霉菌毒素（Diekman&Green,1992;Wood,1992;Sørensen&Elbæk,2002;Monaci&Palmisano,2004;Cavret&Lecoeur,2006）。与牛乳有关的霉菌毒素•除伏马菌素B1外，其他霉菌毒素可经牛体代谢而转化，如黄曲霉毒素B1转化为黄曲霉毒素为M1、赭曲霉素A转化为赭曲霉素-α、玉米赤霉烯酮转化为α-玉米赤霉烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇转化为环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，T-2毒素转化为HT-毒素等多种代谢产物，代谢产物也一并分泌到乳汁中（Fink-Gremmels,2008）。•饲料被霉菌毒素污染是导致牛奶中含有霉菌毒素的主要来源，因此，牛奶中常见的霉菌毒素种类包括饲料中的原毒素及其经牛体的代谢产物。•反刍动物具有瘤胃，瘤胃微生物可代谢一定数量的毒素，起到解毒的作用。体外研究表明，从瘤胃分离的溶纤维丁酸弧菌（B.fibrisolvens）菌株可以转化赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素，降低其毒性（Kiesslinge等,1984;Westlake等,1987;Westlake等,1989）。•霉菌毒素在奶牛肠上皮、肝脏及肾脏内也发生生物转化，主要包括两个阶段的反应。第一阶段包括还原、氧化及水解反应。微粒体的细胞色素P450和单加氧酶类包括黄素、前列腺素类合成酶、氨基氧化酶、醇脱氢酶是参与氧化反应的主要酶类。而还原反应参与的主要酶类是环氧水解酶类、乙醛脱氢酶类、酮脱氢酶类。•哺乳动物的组织和体液中含有大量的非特异性酯酶和水解外来分子的酰胺酶类都参与了第一阶段的反应（Galtier,1999）。第二阶段是第一阶段产生的分子的结合反应。这些反应降低毒素的毒性、提高毒素的水溶性、促进毒素分泌到奶、尿中，对动物起到保护的作用（Dominguez-Bello,1996）。这些聚合酶主要是微粒体葡糖醛酸基转移酶类、细胞溶质磺基转移酶类、甲基转移酶类、氨酰转移酶类、S-谷胱甘肽转移酶类N-乙酰基转移酶类（Galtier,1999）。•此外，还有部分未经转化的毒素也会分泌到奶中，毒素及其代谢物主要通过分泌囊泡以细胞滤过、被动跨膜扩散或主动运输等形式进入奶中（Yiannikouris&Jouany,2002）。•奶牛摄入黄曲霉毒素B1污染的饲料后，只有很少一部分的黄曲霉毒素B1被瘤胃微生物代谢，形成代谢产物羟基化黄曲霉毒素（aflatoxicol）。黄曲霉毒素B1的浓度为1.0~10.0µg/mL，少于10%的黄曲霉毒素B1可被瘤胃微生物代谢。在黄曲霉毒素B1浓度低于10.0µg/mL时，很多瘤胃细菌被抑制，影响瘤胃微生物的生长和代谢活性（Yiannikouris&Jouany,2002）。没有被瘤胃微生物代谢的毒素通过被动扩散进入消化道，在肝脏羟基化形成黄曲霉毒素M1（Kuilman等,2000）。黄曲霉毒素M1既可与葡糖醛酸结合，也可进入全身的循环系统，分泌到尿和乳中（Fink-Gremmels,2008）。•奶牛摄入黄曲霉毒素B148h后，牛奶中检测到的黄曲霉毒素M1含量达到最大值，奶牛停止食用黄曲霉毒素B196h后，奶中检测不到黄曲霉毒素M1（Whitlow等,2000）。•一般认为黄曲霉毒素B1向M1转化的比例很高，但转化程度受多种营养和生理因素影响，如饲养模式、摄入率、消化率、牛体健康状况、肝脏生物转化能力、牛奶产量等。表明黄曲霉毒素的吸收率及黄曲霉毒素M1向乳中的分泌，不同个体间、不同的时期、不同挤奶时间都存在差异。早期研究表明饲料中黄曲霉毒素B1向牛奶中黄曲霉毒素M1的转化率为1~2%（VanEgmond1989）。后又发现，对于高产奶牛转化率可达到6.2%（Veldman等,1992）。2毒性•黄曲霉毒素由黄曲霉菌（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）产生。黄曲霉毒素具有强致癌性，其中黄曲霉毒素B1致癌性最强，1993年被IARC归为一类致癌物，黄曲霉毒素M1为二类致癌物，且二者均为对人类致癌物。此外，黄曲霉毒素还具有遗传毒性等。•急性毒性•新生鸭对黄曲霉毒素B1和M1都很敏感，半数致死量（LethalDose,LD50）为12-16µg/只，组织病理性学结果表明黄曲霉毒素M1与B1对肝的损伤相似，还造成肾小管坏死。自然受到黄曲霉毒素M1污染的牛奶比人为添加黄曲霉毒素M1对肝、肾损伤轻，说明机体对天然和人为添加黄曲霉毒素M1的生物利用率不同。此外，黄曲霉毒素B1和M1对新生鸭急性毒性的机制是相似的，如改变肝主质细胞、糙面内质网核糖体的解离、光面内质网增生等（vanEgmond,1994;JECFA,2001）。•致癌性•饲喂虹鳟含0、5.9、27µg/kg黄曲霉毒素M1、5.8µg/kg黄曲霉毒素B116个月。在5、8、12个月时有鱼死亡。三个处理组及黄曲霉毒素B1对照组都观察到肝脏变性，但没有发现肿瘤及癌前变化。15个月时，饲喂5.8µg/kg黄曲霉毒素B1的处理组肝癌细胞发生率为13%，增生结节发生率为23%；饲喂27.3µg/kg黄曲霉毒素B1的处理组肝癌细胞发生率为2%，增生结节发生率为6%，可见黄曲霉毒素M1的致癌性低于黄曲霉毒素B1（Canton等,1975;vanEgmond,1994;JECFA,2001）。给刚断奶的Fischer小鼠每天饲喂25µg的合成黄曲霉毒素M1，每周5天，持续8周。另一组以相同频率、相同条件给天然黄曲霉毒素B1，M1处理组3%的小鼠形成肝细胞癌、28%肝损伤（瘤前病变）；B1处理组全部小鼠形成肿瘤；无黄曲霉毒素添加的对照组没有显著的肝损伤。再一次证明黄曲霉毒素M1比黄曲霉毒素B1的致癌性低（vanEgmond,1994;JECFA,2001）。•遗传毒性•果蝇体内实验表明：黄曲霉毒素B1和M1可诱导DAN损伤，据此认定其具有基因毒性（Shibahara等,1995;JECFA,2001）。•另有研究表明：具有致畸作用，雄性幼体比雌性更为敏感。3监测•为了解牛奶中霉菌毒素的污染状况，掌握消费者通过牛奶摄入的霉菌毒素的剂量，确保人们的健康，很多国家政府及科研机构对牛奶中的霉菌毒素进行监测，就目前来看，主要监测的仍是具有限量值的且对人类有致癌性的黄曲霉毒素M1。•以及在牛奶中常见且对人类可能有致癌性的赭曲霉毒素A。黄曲霉毒素的主要理化性质B1B2G1G2M1分子式C17H12O6C17H14O6C17H12O7C17H14O7C17H12O7分子量312314328330328融点,℃268～269286～289244～246237～240299溶解性在水中溶解范围为10～20mg/l，可大量溶解于氯仿、甲醇、二甲基亚砜等中等极性的有机溶剂中，不溶于己烷、石油醚和乙醚。稳定性是已发现的真菌毒素中最稳定的一种。加热至熔点时，才开始裂解。在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍不稳定，在pH9-10的强碱溶液中很不稳定。颜色在紫外线下黄曲霉毒素B发蓝色荧光；黄曲霉毒素G发绿色荧光；.黄曲霉毒素M发紫光。纯品结晶为无色。•黄曲霉毒素M1具有较强的发射荧光特性，因此通过肉眼比较定性或者半定量的TLC(薄层层析)法检测方法得到广泛应用（Lin等1998;Krska等,2007;Cigic&Prosen,2009）。TLC法具有适合粗提物的分析、固定相和流动相选择面广、成本低、操作简单快速等优势（Cigic&Prosen,2009）。•更实用的是HPLC-FLC法检测。我国GB5413.37-2010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定中的第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法、GB/T23212-2008牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2的测定及AOAC2000.08液态奶黄曲霉毒素M1含量的测定采用的就是LC-FLD或HPLC-FLD法。大规模进行牛奶中黄曲霉毒素M1的风险监测时也多采用HPLC-FLD法（Martins&Martins,2000;UKFSA,2001;Srivastava等,2001;Boudra等,2007;Sugiyama等,2008;Tajkarimi等,2008;NZFSA,2010）。•近年来，亚洲的阿联酋、伊朗、科威特、日本、泰国、印度尼西亚、中国；欧洲的法国、葡萄牙、意大利、英国、阿尔巴尼亚；美洲的阿根廷、巴西及大洋洲的新西兰都有在生乳中监测黄曲霉毒素M1的报道，主要采用的检测方法为HPLC法和ELISA（酶联免疫吸附测试）法。•各国的限量有所不同，其中亚洲以0.5μg/L为主，欧洲以0.05μg/L为主。就监测结果来看，除意大利和新西兰没有检测到阳性样品外，其他各国的生乳中均有不同程度黄曲霉毒素M1的检出，以两个代表限量为界限对各国阳性样品中黄曲霉毒素M1的含量进行比较分析，日本、英国、法国、葡萄牙、阿根廷的阳性样品中黄曲霉毒素M1的含量均在0.05μg/L之内；伊朗、阿联酋、科威特、中国的阳性样品超0.05μg/L，但在0.5μg/L之内；而泰国、印度尼西亚、阿尔巴尼及巴西的阳性样品甚至超出0.5μg/L的限量。•就全球范围来看，我国生乳中黄曲霉毒素M1的污染属于中等水平。4加工应对的局限性•食品加工技术对消除黄曲霉毒素的毒性缺乏有效方法。包括对多种兽药残留物、农药残留物、以及多种细菌的有毒代谢产物等危害因素，现在的乳品加工业均束手无策无能为力。•因此乳品工业还不得不依赖源头的良好生产过程，“牧场是第一车间”的断论，至今还是一句颠扑不破的经典名言。牧场是第一车间•奶牛，自在地生活在它的食物链上，才能活得健康。饲料的地位•然后，人类才能获得健康的奶类资源。•人类属于地球上进化程度最高的哺乳动物纲，在5千多种哺乳动物中是进化程度最高的一种。•历史的选择：作为人类食物资源利用的动物奶汁，均出自反刍动物。•草食的反刍动物虽然与我们人类同属哺乳动物纲，具有相近的基