1-1人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析

人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析中南大学生命科学学院2LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—2—第一节实验目的•掌握人类基因组DNA提取的基本原理和方法•掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法3LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—3—第二节实验原理4相关知识核酸提取思路：破膜：细胞膜、核膜分离：通过酶，有机溶剂，调节pH值，离心等纯化：去除杂质5DNA提取原则：保证DNA一级结构的完整性排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染相关知识6样品来源：培养细胞组织标本血液样本相关知识7实验原理用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。8第一节实验原理离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。高盐，低pH值：选择性结合DNA漂洗低盐，高pH值：DNA从硅基质膜上洗脱9LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—9—第三节主要试剂10主要试剂培养细胞RNaseA（100mg/ml）ProteaseBufferGRBufferGL无水乙醇BufferGW1BufferGW2BufferGE11LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—11—第四节主要仪器12微量移液器台式微量离心机电泳仪凝胶成像系统主要仪器LIFE13LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—13—第五节操作步骤14LOGOLIFE1.样品处理：取1管细胞，做好标记，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。3.向以上溶液中加入20μlProteaseK，混匀。4.加入200μlBufferGL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。注意：不要直接将Protease直接加入到BufferGL。5.56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次6.加入200μl无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。第五节操作步骤7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。2.加入200μlGR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。15LOGOLIFE10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60μlBufferGE，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。7.向吸附柱中加入500μlBufferGW1，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8.向吸附柱中加入500μlBufferGW2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。9.10,000rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。第五节操作步骤11.取5-10μl基因组DNA，并加入2μl上样缓冲液，混匀，加样到1％琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。16LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—16—第六节注意事项17LOGOLIFE（1）试剂配制及保存规范，离心管及Tip头需经高压灭菌处理。（2）基因组DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中尽量轻缓，避免过度的溶液吹打转移，以及过高的温度。第六节注意事项18LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—18—第七节结果分析19LOGOLIFE第七节结果分析量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量：a.纯度越纯越好。A260/A280越接近1.8越好b.分子量越大越好。DNA分子量大于30KB，可满足一般实验要求。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果:靠近点样孔，落后于Marker最后一条区带(约21KB)的位置可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小分子量区带（RNA）。20LOGOM:λDNA/HindIII+EcoRIDNAMarker；1-5:基因组DNA基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图第七节结果分析LIFE21226bpM1234521LOGOContentsPage目录页子目录TRANSITIONPAGE—21—课程相关资源22LOGOLIFE课程简介课程简介《医学分子生物学》----国家精品资源共享课，2013（）《医学分子生物学》----国家精品课程(本科），2008（）生命科学学院资源共享平台（）[e-mail]0731-84805449